Để có hiệu quảkiểm soát muỗivà giảm tỷ lệ mắc bệnh do chúng mang theo, cần có các giải pháp thay thế chiến lược, bền vững và thân thiện với môi trường cho thuốc trừ sâu hóa học. Chúng tôi đã đánh giá bột hạt từ một số loài thuộc họ Cải (Brassicaceae) như một nguồn isothiocyanate có nguồn gốc thực vật được sản xuất bằng phương pháp thủy phân enzyme các glucosinolate không hoạt động sinh học để sử dụng trong việc kiểm soát muỗi vằn Ai Cập (L., 1762). Bột hạt năm loại đã khử chất béo (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 và Thlaspi arvense – ba loại chính của bất hoạt nhiệt và phân hủy bằng enzym Sản phẩm hóa học Để xác định độc tính (LC50) của allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate và 4-hydroxybenzylisothiocyanate đối với ấu trùng Aedes aegypti sau 24 giờ tiếp xúc = 0,04 g/120 ml dH2O). Giá trị LC50 đối với mù tạt, mù tạt trắng và mộc tặc. Bột hạt lần lượt là 0,05, 0,08 và 0,05 so với allyl isothiocyanate (LC50 = 19,35 ppm) và 4. -Hydroxybenzylisothiocyanate (LC50 = 55,41 ppm) độc hơn đối với ấu trùng trong vòng 24 giờ sau khi xử lý so với 0,1 g/120 ml dH2O. Những kết quả này phù hợp với việc sản xuất bột hạt cỏ linh lăng. Hiệu quả cao hơn của este benzyl tương ứng với các giá trị LC50 được tính toán. Sử dụng bột hạt có thể cung cấp một phương pháp diệt muỗi hiệu quả. Hiệu quả của bột hạt họ cải và các thành phần hóa học chính của nó đối với ấu trùng muỗi và cho thấy các hợp chất tự nhiên trong bột hạt họ cải có thể đóng vai trò là một loại thuốc diệt ấu trùng thân thiện với môi trường đầy hứa hẹn để diệt muỗi.
Các bệnh do muỗi truyền do véc tơ gây ra vẫn là một vấn đề lớn về sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Tỷ lệ mắc các bệnh do muỗi truyền lan rộng về mặt địa lý1,2,3 và tái phát, dẫn đến các đợt bùng phát bệnh nghiêm trọng4,5,6,7. Sự lây lan của các bệnh giữa người và động vật (ví dụ, chikungunya, sốt xuất huyết, sốt Rift Valley, sốt vàng da và vi-rút Zika) là chưa từng có. Chỉ riêng sốt xuất huyết đã khiến khoảng 3,6 tỷ người ở vùng nhiệt đới có nguy cơ nhiễm trùng, với ước tính 390 triệu ca nhiễm xảy ra hàng năm, dẫn đến 6.100–24.300 ca tử vong mỗi năm8. Sự tái xuất hiện và bùng phát của vi-rút Zika ở Nam Mỹ đã thu hút sự chú ý trên toàn thế giới do tổn thương não mà nó gây ra ở trẻ em sinh ra từ những phụ nữ bị nhiễm bệnh2. Kremer và cộng sự 3 dự đoán rằng phạm vi địa lý của muỗi Aedes sẽ tiếp tục mở rộng và đến năm 2050, một nửa dân số thế giới sẽ có nguy cơ bị nhiễm các loại vi-rút arbovirus do muỗi truyền.
Ngoại trừ các loại vắc-xin phòng sốt xuất huyết và sốt vàng da mới được phát triển, vắc-xin phòng hầu hết các bệnh do muỗi truyền vẫn chưa được phát triển9,10,11. Vắc-xin vẫn còn hạn chế về số lượng và chỉ được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng. Kiểm soát vật trung gian truyền bệnh là một chiến lược quan trọng để kiểm soát sự lây lan của các bệnh do muỗi truyền12,13. Mặc dù thuốc trừ sâu tổng hợp có hiệu quả trong việc tiêu diệt muỗi, nhưng việc tiếp tục sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp lại ảnh hưởng tiêu cực đến các sinh vật không phải mục tiêu và gây ô nhiễm môi trường14,15,16. Đáng báo động hơn nữa là xu hướng muỗi kháng thuốc hóa học ngày càng tăng17,18,19. Những vấn đề liên quan đến thuốc trừ sâu đã thúc đẩy việc tìm kiếm các giải pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với môi trường để kiểm soát vật trung gian truyền bệnh.
Nhiều loại thực vật đã được phát triển làm nguồn thuốc trừ sâu thực vật để kiểm soát dịch hại20,21. Các chất thực vật thường thân thiện với môi trường vì chúng có thể phân huỷ sinh học và có độc tính thấp hoặc không đáng kể đối với các sinh vật không phải mục tiêu như động vật có vú, cá và động vật lưỡng cư20,22. Các chế phẩm thảo dược được biết là tạo ra nhiều hợp chất hoạt tính sinh học với các cơ chế hoạt động khác nhau để kiểm soát hiệu quả các giai đoạn sống khác nhau của muỗi23,24,25,26. Các hợp chất có nguồn gốc thực vật như tinh dầu và các thành phần thực vật hoạt tính khác đã thu hút sự chú ý và mở đường cho các công cụ cải tiến để kiểm soát vật trung gian truyền muỗi. Tinh dầu, monoterpen và sesquiterpen hoạt động như chất xua đuổi, chất ngăn chặn ăn và chất diệt muỗi27,28,29,30,31,32,33. Nhiều loại dầu thực vật gây chết ấu trùng, nhộng và muỗi trưởng thành34,35,36, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, hô hấp, nội tiết và các hệ thống quan trọng khác của côn trùng37.
Các nghiên cứu gần đây đã cung cấp cái nhìn sâu sắc về tiềm năng sử dụng cây mù tạt và hạt của chúng như một nguồn hợp chất hoạt tính sinh học. Bột hạt mù tạt đã được thử nghiệm như một chất xông hơi sinh học38,39,40,41 và được sử dụng làm chất cải tạo đất để diệt cỏ dại42,43,44 và kiểm soát các mầm bệnh thực vật có trong đất45,46,47,48,49,50, dinh dưỡng thực vật, tuyến trùng 41,51, 52, 53, 54 và sâu bệnh 55, 56, 57, 58, 59, 60. Hoạt động diệt nấm của các loại bột hạt này được cho là nhờ các hợp chất bảo vệ thực vật được gọi là isothiocyanates38,42,60. Ở thực vật, các hợp chất bảo vệ này được lưu trữ trong tế bào thực vật dưới dạng glucosinolate không hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, khi cây bị hư hại do côn trùng ăn hoặc nhiễm mầm bệnh, glucosinolate bị thủy phân bởi myrosinase thành isothiocyanates hoạt tính sinh học55,61. Isothiocyanates là hợp chất dễ bay hơi được biết đến có hoạt tính kháng khuẩn và diệt côn trùng phổ rộng, và cấu trúc, hoạt tính sinh học cũng như hàm lượng của chúng thay đổi rất nhiều giữa các loài thuộc họ Cải42,59,62,63.
Mặc dù isothiocyanate chiết xuất từ bột hạt mù tạt được biết là có hoạt tính diệt côn trùng, nhưng dữ liệu về hoạt tính sinh học chống lại các loài chân khớp quan trọng về mặt y học vẫn còn thiếu. Nghiên cứu của chúng tôi đã kiểm tra hoạt tính diệt ấu trùng của bốn loại bột hạt đã tách béo đối với muỗi Aedes. Ấu trùng của muỗi Aedes aegypti. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá tiềm năng sử dụng chúng như thuốc trừ sâu sinh học thân thiện với môi trường để kiểm soát muỗi. Ba thành phần hóa học chính của bột hạt, allyl isothiocyanate (AITC), benzyl isothiocyanate (BITC) và 4-hydroxybenzylisothiocyanate (4-HBITC) cũng đã được thử nghiệm để kiểm tra hoạt tính sinh học của các thành phần hóa học này trên ấu trùng muỗi. Đây là báo cáo đầu tiên đánh giá hiệu quả của bốn loại bột hạt bắp cải và các thành phần hóa học chính của chúng đối với ấu trùng muỗi.
Các đàn muỗi Aedes aegypti (chủng Rockefeller) trong phòng thí nghiệm được duy trì ở nhiệt độ 26°C, độ ẩm tương đối (RH) 70% và chu kỳ quang hợp L:D là 10:14 giờ. Những con cái đã giao phối được nhốt trong lồng nhựa (cao 11 cm và đường kính 9,5 cm) và được cho ăn qua hệ thống cho ăn bằng bình sử dụng máu bò đã được xử lý bằng citrate (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, Hoa Kỳ). Việc cho ăn máu được thực hiện như bình thường bằng cách sử dụng máng ăn nhiều lớp màng (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, Hoa Kỳ) được kết nối với ống tắm tuần hoàn nước (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ) với nhiệt độ kiểm soát là 37°C. Trải một lớp màng Parafilm M xuống đáy mỗi khoang nuôi bằng kính (diện tích 154 mm2). Sau đó, mỗi máng ăn được đặt lên lưới trên cùng che phủ lồng chứa con cái đang giao phối. Khoảng 350–400 μl máu bò được thêm vào phễu thủy tinh bằng pipet Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ) và để giun trưởng thành chảy ra trong ít nhất một giờ. Sau đó, giun cái mang thai được cho uống dung dịch sucrose 10% và đẻ trứng trên giấy lọc ẩm lót trong từng cốc soufflé siêu trong (kích thước 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, Hoa Kỳ). lồng có nước. Đặt giấy lọc chứa trứng vào túi kín (SC Johnsons, Racine, WI) và bảo quản ở 26°C. Trứng nở và khoảng 200–250 ấu trùng được nuôi trong khay nhựa chứa hỗn hợp thức ăn cho thỏ (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, Hoa Kỳ) và bột gan (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, Hoa Kỳ). và phi lê cá (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Đức) theo tỷ lệ 2:1:1. Ấu trùng giai đoạn 3 muộn được sử dụng trong các xét nghiệm sinh học của chúng tôi.
Vật liệu hạt giống thực vật được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ các nguồn thương mại và chính phủ sau: Brassica juncea (mù tạt nâu-Pacific Gold) và Brassica juncea (mù tạt trắng-Ida Gold) từ Hợp tác xã Nông dân Tây Bắc Thái Bình Dương, Tiểu bang Washington, Hoa Kỳ; (Cải xoong vườn) từ Công ty Kelly Seed and Hardware, Peoria, IL, Hoa Kỳ và Thlaspi arvense (Cải xoong cánh đồng-Elisabeth) từ USDA-ARS, Peoria, IL, Hoa Kỳ; Không có hạt giống nào được sử dụng trong nghiên cứu này được xử lý bằng thuốc trừ sâu. Tất cả vật liệu hạt giống đều được xử lý và sử dụng trong nghiên cứu này theo các quy định của địa phương và quốc gia và tuân thủ tất cả các quy định của tiểu bang và quốc gia có liên quan. Nghiên cứu này không xem xét các giống cây trồng chuyển gen.
Hạt cải Brassica juncea (PG), cỏ linh lăng (Ls), mù tạt trắng (IG), hạt Thlaspi arvense (DFP) được nghiền thành bột mịn bằng máy nghiền siêu ly tâm Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Đức) được trang bị lưới 0,75 mm và rôto bằng thép không gỉ, 12 răng, tốc độ 10.000 vòng/phút (Bảng 1). Bột hạt đã nghiền được chuyển vào ống giấy và khử chất béo bằng hexan trong thiết bị Soxhlet trong 24 giờ. Một mẫu mù tạt đồng ruộng đã khử chất béo được xử lý nhiệt ở 100 °C trong 1 giờ để biến tính myrosinase và ngăn chặn quá trình thủy phân glucosinolate tạo thành isothiocyanate có hoạt tính sinh học. Bột hạt đuôi ngựa đã xử lý nhiệt (DFP-HT) được sử dụng làm đối chứng âm tính bằng cách biến tính myrosinase.
Hàm lượng glucosinolate trong bột hạt đã tách béo được xác định ba lần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo giao thức đã công bố trước đó 64. Tóm lại, 3 mL methanol được thêm vào 250 mg mẫu bột hạt đã tách béo. Mỗi mẫu được siêu âm trong bồn nước trong 30 phút và để trong bóng tối ở 23°C trong 16 giờ. Sau đó, lọc 1 mL lớp hữu cơ qua bộ lọc 0,45 μm vào máy lấy mẫu tự động. Chạy trên hệ thống HPLC Shimadzu (hai bơm LC 20AD; máy lấy mẫu tự động SIL 20A; bộ khử khí DGU 20As; đầu dò UV-VIS SPD-20A để theo dõi ở bước sóng 237 nm; và mô-đun bus truyền thông CBM-20A), hàm lượng glucosinolate trong bột hạt đã được xác định ba lần bằng phần mềm Shimadzu LC Solution phiên bản 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, Hoa Kỳ). Cột là cột pha đảo C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, Hoa Kỳ). Các điều kiện pha động ban đầu được thiết lập ở mức 12% methanol/88% tetrabutylammonium hydroxide 0,01 M trong nước (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) với tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút. Sau khi tiêm 15 μl mẫu, các điều kiện ban đầu được duy trì trong 20 phút, sau đó tỷ lệ dung môi được điều chỉnh thành 100% methanol, với tổng thời gian phân tích mẫu là 65 phút. Đường chuẩn (dựa trên nM/mAb) được tạo ra bằng cách pha loãng nối tiếp các chuẩn sinapine, glucosinolate và myrosin mới chuẩn bị (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ) để ước tính hàm lượng lưu huỳnh trong bột hạt đã khử chất béo. glucosinolate. Nồng độ glucosinolate trong các mẫu được thử nghiệm trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, Hoa Kỳ) bằng phiên bản OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) được trang bị cùng một cột và sử dụng phương pháp đã mô tả trước đây. Nồng độ glucosinolate đã được xác định; có thể so sánh giữa các hệ thống HPLC.
Allyl isothiocyanate (94%, ổn định) và benzyl isothiocyanate (98%) được mua từ Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). 4-Hydroxybenzylisothiocyanate được mua từ ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, Hoa Kỳ). Khi thủy phân bằng enzyme myrosinase, glucosinolate, glucosinolate và glucosinolate tạo thành allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate và 4-hydroxybenzylisothiocyanate.
Các xét nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Muturi et al. 32 với các sửa đổi. Năm loại thức ăn hạt ít béo đã được sử dụng trong nghiên cứu: DFP, DFP-HT, IG, PG và Ls. Hai mươi ấu trùng được đặt trong cốc thủy tinh ba chiều dùng một lần dung tích 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, Hoa Kỳ) chứa 120 mL nước khử ion (dH2O). Bảy nồng độ bột hạt đã được thử nghiệm về độc tính đối với ấu trùng muỗi: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 và 0,12 g bột hạt/120 ml dH2O đối với bột hạt DFP, DFP-HT, IG và PG. Các xét nghiệm sinh học sơ bộ cho thấy bột hạt Ls đã khử béo độc hơn bốn loại bột hạt khác đã được thử nghiệm. Do đó, chúng tôi đã điều chỉnh bảy nồng độ xử lý của bột hạt Ls thành các nồng độ sau: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 và 0,075 g/120 mL dH2O.
Một nhóm đối chứng chưa xử lý (dH20, không bổ sung bột hạt) được đưa vào để đánh giá tỷ lệ tử vong thông thường của côn trùng trong điều kiện thử nghiệm. Các xét nghiệm sinh học về độc tính đối với mỗi loại bột hạt bao gồm ba cốc thủy tinh ba dốc lặp lại (20 ấu trùng giai đoạn 3 muộn trên mỗi cốc), tổng cộng là 108 lọ. Các hộp chứa đã xử lý được bảo quản ở nhiệt độ phòng (20-21°C) và tỷ lệ tử vong của ấu trùng được ghi lại trong 24 và 72 giờ tiếp xúc liên tục với nồng độ xử lý. Nếu cơ thể và các phần phụ của muỗi không chuyển động khi bị đâm hoặc chạm bằng thìa thép không gỉ mỏng, thì ấu trùng muỗi được coi là đã chết. Ấu trùng chết thường nằm bất động ở vị trí lưng hoặc bụng ở đáy hộp chứa hoặc trên bề mặt nước. Thí nghiệm được lặp lại ba lần vào những ngày khác nhau bằng cách sử dụng các nhóm ấu trùng khác nhau, tổng cộng là 180 ấu trùng tiếp xúc với mỗi nồng độ xử lý.
Độc tính của AITC, BITC và 4-HBITC đối với ấu trùng muỗi được đánh giá bằng cùng một quy trình xét nghiệm sinh học nhưng với các phương pháp xử lý khác nhau. Chuẩn bị dung dịch gốc 100.000 ppm cho mỗi hóa chất bằng cách thêm 100 µL hóa chất vào 900 µL ethanol tuyệt đối trong ống ly tâm 2 mL và lắc trong 30 giây để trộn đều. Nồng độ xử lý được xác định dựa trên các xét nghiệm sinh học sơ bộ của chúng tôi, cho thấy BITC độc hơn nhiều so với AITC và 4-HBITC. Để xác định độc tính, 5 nồng độ BITC (1, 3, 6, 9 và 12 ppm), 7 nồng độ AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 và 35 ppm) và 6 nồng độ 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 và 35 ppm). (30, 45, 60, 75 và 90 ppm). Nghiệm thức đối chứng được tiêm 108 μL ethanol tuyệt đối, tương đương với thể tích tối đa của nghiệm thức hóa học. Các xét nghiệm sinh học được lặp lại như trên, cho tổng cộng 180 ấu trùng tiếp xúc với mỗi nồng độ xử lý. Tỷ lệ tử vong của ấu trùng được ghi nhận cho mỗi nồng độ AITC, BITC và 4-HBITC sau 24 giờ tiếp xúc liên tục.
Phân tích Probit của 65 dữ liệu về tỷ lệ tử vong liên quan đến liều đã được thực hiện bằng phần mềm Polo (Polo Plus, LeOra Software, phiên bản 1.0) để tính nồng độ gây chết 50% (LC50), nồng độ gây chết 90% (LC90), độ dốc, hệ số liều gây chết và nồng độ gây chết 95%, dựa trên các khoảng tin cậy cho tỷ lệ liều gây chết đối với nồng độ chuyển đổi logarit và đường cong liều-tử vong. Dữ liệu về tỷ lệ tử vong dựa trên dữ liệu lặp lại kết hợp của 180 ấu trùng tiếp xúc với từng nồng độ xử lý. Phân tích xác suất được thực hiện riêng cho từng loại bột hạt và từng thành phần hóa học. Dựa trên khoảng tin cậy 95% của tỷ lệ liều gây chết, độc tính của bột hạt và các thành phần hóa học đối với ấu trùng muỗi được coi là khác biệt đáng kể, do đó khoảng tin cậy chứa giá trị 1 không khác biệt đáng kể, P = 0,0566.
Kết quả HPLC để xác định các glucosinolate chính trong bột hạt đã tách béo DFP, IG, PG và Ls được liệt kê trong Bảng 1. Các glucosinolate chính trong bột hạt được thử nghiệm rất đa dạng, ngoại trừ DFP và PG, cả hai đều chứa glucosinolate myrosinase. Hàm lượng myrosinin trong PG cao hơn trong DFP, lần lượt là 33,3 ± 1,5 và 26,5 ± 0,9 mg/g. Bột hạt Ls chứa 36,6 ± 1,2 mg/g glucoglycone, trong khi bột hạt IG chứa 38,0 ± 0,5 mg/g sinapine.
Ấu trùng muỗi Ae. Aedes aegypti bị tiêu diệt khi được xử lý bằng bột hạt đã tách béo, mặc dù hiệu quả của phương pháp xử lý khác nhau tùy thuộc vào loài thực vật. Chỉ có DFP-NT không gây độc cho ấu trùng muỗi sau 24 và 72 giờ tiếp xúc (Bảng 2). Độc tính của bột hạt hoạt tính tăng theo nồng độ tăng (Hình 1A, B). Độc tính của bột hạt đối với ấu trùng muỗi thay đổi đáng kể dựa trên 95% CI của tỷ lệ liều gây chết của giá trị LC50 tại các đánh giá 24 giờ và 72 giờ (Bảng 3). Sau 24 giờ, tác dụng độc của bột hạt Ls lớn hơn các phương pháp xử lý bột hạt khác, với hoạt tính cao nhất và độc tính tối đa đối với ấu trùng (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Ấu trùng kém nhạy cảm với DFP sau 24 giờ so với các nghiệm thức bột hạt IG, Ls và PG, với giá trị LC50 lần lượt là 0,115, 0,04 và 0,08 g/120 ml dH2O, cao hơn đáng kể so với giá trị LC50 là 0,211 g/120 ml dH2O (Bảng 3). Giá trị LC90 của DFP, IG, PG và Ls lần lượt là 0,376, 0,275, 0,137 và 0,074 g/120 ml dH2O (Bảng 2). Nồng độ DPP cao nhất là 0,12 g/120 ml dH2O. Sau 24 giờ đánh giá, tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng chỉ là 12%, trong khi tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng IG và PG lần lượt đạt 51% và 82%. Sau 24 giờ đánh giá, tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng ở nồng độ xử lý bột hạt Ls cao nhất (0,075 g/120 ml dH2O) là 99% (Hình 1A).
Đường cong tỷ lệ tử vong được ước tính dựa trên đáp ứng liều (Probit) của ấu trùng Ae. Egyptian (ấu trùng tuổi 3) với nồng độ bột hạt sau 24 giờ (A) và 72 giờ (B) sau khi xử lý. Đường chấm chấm thể hiện LC50 của chế độ xử lý bột hạt. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense bất hoạt bằng nhiệt, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Khi đánh giá sau 72 giờ, giá trị LC50 của bột hạt DFP, IG và PG lần lượt là 0,111, 0,085 và 0,051 g/120 ml dH2O. Hầu hết ấu trùng tiếp xúc với bột hạt Ls đều chết sau 72 giờ tiếp xúc, do đó dữ liệu về tỷ lệ tử vong không phù hợp với phân tích Probit. So với các loại bột hạt khác, ấu trùng ít nhạy cảm hơn với việc xử lý bột hạt DFP và có giá trị LC50 cao hơn về mặt thống kê (Bảng 2 và 3). Sau 72 giờ, giá trị LC50 đối với việc xử lý bột hạt DFP, IG và PG lần lượt được ước tính là 0,111, 0,085 và 0,05 g/120 ml dH2O. Sau 72 giờ đánh giá, giá trị LC90 của bột hạt DFP, IG và PG lần lượt là 0,215, 0,254 và 0,138 g/120 ml dH2O. Sau 72 giờ đánh giá, tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng đối với các chế phẩm bột hạt DFP, IG và PG ở nồng độ tối đa 0,12 g/120 ml dH2O lần lượt là 58%, 66% và 96% (Hình 1B). Sau 72 giờ đánh giá, bột hạt PG được phát hiện độc hơn bột hạt IG và DFP.
Các isothiocyanate tổng hợp, allyl isothiocyanate (AITC), benzyl isothiocyanate (BITC) và 4-hydroxybenzylisothiocyanate (4-HBITC) có thể tiêu diệt ấu trùng muỗi hiệu quả. Sau 24 giờ xử lý, BITC độc hơn đối với ấu trùng với giá trị LC50 là 5,29 ppm so với 19,35 ppm của AITC và 55,41 ppm của 4-HBITC (Bảng 4). So với AITC và BITC, 4-HBITC có độc tính thấp hơn và giá trị LC50 cao hơn. Có sự khác biệt đáng kể về độc tính đối với ấu trùng muỗi của hai isothiocyanate chính (Ls và PG) trong bột hạt mạnh nhất. Độc tính dựa trên tỷ lệ liều gây chết của các giá trị LC50 giữa AITC, BITC và 4-HBITC cho thấy sự khác biệt về mặt thống kê, theo đó, CI 95% của tỷ lệ liều gây chết LC50 không bao gồm giá trị 1 (P = 0,05, Bảng 4). Nồng độ cao nhất của cả BITC và AITC được ước tính có thể tiêu diệt 100% ấu trùng được thử nghiệm (Hình 2).
Đường cong tỷ lệ tử vong được ước tính dựa trên đáp ứng liều (Probit) của muỗi Ae. 24 giờ sau khi xử lý, ấu trùng Ai Cập (ấu trùng tuổi 3) đạt nồng độ isothiocyanate tổng hợp. Đường chấm chấm thể hiện LC50 của phương pháp xử lý isothiocyanate. Benzyl isothiocyanate BITC, allyl isothiocyanate AITC và 4-HBITC.
Việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học từ thực vật làm tác nhân kiểm soát muỗi đã được nghiên cứu từ lâu. Nhiều loại thực vật sản sinh ra các hóa chất tự nhiên có hoạt tính diệt côn trùng37. Các hợp chất hoạt tính sinh học của chúng là một giải pháp thay thế hấp dẫn cho thuốc trừ sâu tổng hợp với tiềm năng to lớn trong việc kiểm soát các loài gây hại, bao gồm cả muỗi.
Cây mù tạt được trồng như một loại cây lấy hạt, dùng làm gia vị và nguồn dầu. Khi dầu mù tạt được chiết xuất từ hạt hoặc khi mù tạt được chiết xuất để sử dụng làm nhiên liệu sinh học,69 sản phẩm phụ là bột hạt đã tách béo. Bột hạt này vẫn giữ được nhiều thành phần sinh hóa tự nhiên và các enzyme thủy phân. Độc tính của bột hạt này được cho là do sản xuất ra isothiocyanates55,60,61. Isothiocyanates được hình thành do quá trình thủy phân glucosinolate bởi enzyme myrosinase trong quá trình hydrat hóa bột hạt38,55,70 và được biết là có tác dụng diệt nấm, diệt khuẩn, diệt tuyến trùng và diệt côn trùng, cũng như các đặc tính khác bao gồm tác dụng cảm quan hóa học và đặc tính hóa trị liệu61,62,70. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây mù tạt và bột hạt có tác dụng xông hơi hiệu quả đối với sâu bệnh trong đất và thực phẩm dự trữ57,59,71,72. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá độc tính của bột bốn hạt và ba sản phẩm hoạt tính sinh học của nó là AITC, BITC và 4-HBITC đối với ấu trùng muỗi Aedes. Aedes aegypti. Việc thêm bột hạt trực tiếp vào nước có ấu trùng muỗi được kỳ vọng sẽ kích hoạt các quá trình enzyme sản xuất isothiocyanate độc hại đối với ấu trùng muỗi. Sự chuyển đổi sinh học này đã được chứng minh một phần bởi hoạt động diệt ấu trùng quan sát được của bột hạt và mất hoạt tính diệt côn trùng khi bột hạt mù tạt lùn được xử lý nhiệt trước khi sử dụng. Xử lý nhiệt được kỳ vọng sẽ phá hủy các enzyme thủy phân kích hoạt glucosinolate, do đó ngăn chặn sự hình thành các isothiocyanate hoạt tính sinh học. Đây là nghiên cứu đầu tiên xác nhận đặc tính diệt côn trùng của bột hạt bắp cải đối với muỗi trong môi trường nước.
Trong số các loại bột hạt được thử nghiệm, bột hạt cải xoong (Ls) là loại độc nhất, gây tử vong cao cho muỗi Aedes albopictus. Ấu trùng Aedes aegypti được xử lý liên tục trong 24 giờ. Ba loại bột hạt còn lại (PG, IG và DFP) có hoạt tính chậm hơn và vẫn gây tử vong đáng kể sau 72 giờ xử lý liên tục. Chỉ có bột hạt Ls mới chứa một lượng đáng kể glucosinolate, trong khi PG và DFP chứa myrosinase và IG chứa glucosinolate là glucosinolate chính (Bảng 1). Glucotropaeolin được thủy phân thành BITC và sinalbine được thủy phân thành 4-HBITC61,62. Kết quả xét nghiệm sinh học của chúng tôi chỉ ra rằng cả bột hạt Ls và BITC tổng hợp đều có độc tính cao đối với ấu trùng muỗi. Thành phần chính của bột hạt PG và DFP là myrosinase glucosinolate, được thủy phân thành AITC. AITC có hiệu quả trong việc tiêu diệt ấu trùng muỗi với giá trị LC50 là 19,35 ppm. So với AITC và BITC, isothiocyanate 4-HBITC ít độc hơn đối với ấu trùng. Mặc dù AITC ít độc hơn BITC, nhưng giá trị LC50 của chúng thấp hơn nhiều loại tinh dầu đã được thử nghiệm trên ấu trùng muỗi32,73,74,75.
Bột hạt họ cải của chúng tôi dùng để chống ấu trùng muỗi chứa một loại glucosinolate chính, chiếm hơn 98-99% tổng số glucosinolate được xác định bằng HPLC. Một lượng nhỏ các glucosinolate khác đã được phát hiện, nhưng mức độ của chúng ít hơn 0,3% tổng số glucosinolate. Bột hạt cải xoong (L. sativum) chứa glucosinolate thứ cấp (sinigrin), nhưng tỷ lệ của chúng là 1% tổng số glucosinolate và hàm lượng của chúng vẫn không đáng kể (khoảng 0,4 mg/g bột hạt). Mặc dù PG và DFP chứa cùng một loại glucosinolate chính (myrosin), nhưng hoạt động diệt ấu trùng của bột hạt của chúng khác nhau đáng kể do giá trị LC50 của chúng. Độc tính khác nhau đối với bệnh phấn trắng. Sự xuất hiện của ấu trùng Aedes aegypti có thể là do sự khác biệt về hoạt động của myrosinase hoặc độ ổn định giữa hai loại thức ăn hạt này. Hoạt động của myrosinase đóng một vai trò quan trọng trong khả dụng sinh học của các sản phẩm thủy phân như isothiocyanate trong cây họ cải76. Các báo cáo trước đây của Pocock et al.77 và Wilkinson et al.78 đã chỉ ra rằng những thay đổi trong hoạt động và độ ổn định của myrosinase cũng có thể liên quan đến các yếu tố di truyền và môi trường.
Hàm lượng isothiocyanate hoạt tính sinh học dự kiến được tính toán dựa trên giá trị LC50 của mỗi loại bột hạt sau 24 và 72 giờ (Bảng 5) để so sánh với các ứng dụng hóa chất tương ứng. Sau 24 giờ, các isothiocyanate trong bột hạt độc hơn các hợp chất tinh khiết. Giá trị LC50 được tính toán dựa trên phần triệu (ppm) của các phương pháp xử lý hạt isothiocyanate thấp hơn giá trị LC50 đối với các ứng dụng BITC, AITC và 4-HBITC. Chúng tôi đã quan sát thấy ấu trùng tiêu thụ viên bột hạt (Hình 3A). Do đó, ấu trùng có thể tiếp xúc tập trung hơn với các isothiocyanate độc hại bằng cách ăn viên bột hạt. Điều này thể hiện rõ nhất ở các phương pháp xử lý bột hạt IG và PG sau 24 giờ tiếp xúc, trong đó nồng độ LC50 thấp hơn lần lượt là 75% và 72% so với các phương pháp xử lý AITC và 4-HBITC tinh khiết. Xử lý bằng Ls và DFP độc hơn so với isothiocyanate nguyên chất, với giá trị LC50 thấp hơn lần lượt 24% và 41%. Ấu trùng ở nghiệm thức đối chứng đã hóa nhộng thành công (Hình 3B), trong khi hầu hết ấu trùng ở nghiệm thức bột hạt không hóa nhộng và quá trình phát triển của ấu trùng bị chậm lại đáng kể (Hình 3B,D). Ở loài Spodopteralitura, isothiocyanate có liên quan đến sự chậm phát triển và chậm phát triển79.
Ấu trùng muỗi Ae. Aedes aegypti được tiếp xúc liên tục với bột hạt cải Brassica trong 24–72 giờ. (A) Ấu trùng chết có các hạt bột hạt trong miệng (được khoanh tròn); (B) Xử lý đối chứng (dH20 không thêm bột hạt) cho thấy ấu trùng phát triển bình thường và bắt đầu hóa nhộng sau 72 giờ (C, D) Ấu trùng được xử lý bằng bột hạt; bột hạt cho thấy sự khác biệt trong quá trình phát triển và không hóa nhộng.
Chúng tôi chưa nghiên cứu cơ chế tác động độc hại của isothiocyanate lên ấu trùng muỗi. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây trên kiến lửa đỏ (Solenopsis invicta) đã chỉ ra rằng ức chế glutathione S-transferase (GST) và esterase (EST) là cơ chế chính của hoạt tính sinh học của isothiocyanate, và AITC, ngay cả ở mức hoạt động thấp, cũng có thể ức chế hoạt động của GST. Kiến lửa đỏ nhập khẩu ở nồng độ thấp. Liều dùng là 0,5 µg/ml80. Ngược lại, AITC ức chế acetylcholinesterase ở bọ cánh cứng ngô trưởng thành (Sitophilus zeamais)81. Các nghiên cứu tương tự cần được thực hiện để làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của isothiocyanate ở ấu trùng muỗi.
Chúng tôi sử dụng phương pháp xử lý DFP bất hoạt bằng nhiệt để hỗ trợ cho đề xuất rằng quá trình thủy phân glucosinolate thực vật để tạo thành isothiocyanate phản ứng đóng vai trò là cơ chế kiểm soát ấu trùng muỗi bằng bột hạt mù tạt. Bột hạt DFP-HT không độc hại ở liều lượng sử dụng đã thử nghiệm. Lafarga và cộng sự. 82 đã báo cáo rằng glucosinolate nhạy cảm với sự phân hủy ở nhiệt độ cao. Xử lý nhiệt cũng được cho là sẽ làm biến tính enzyme myrosinase trong bột hạt và ngăn chặn quá trình thủy phân glucosinolate để tạo thành isothiocyanate phản ứng. Điều này cũng đã được Okunade và cộng sự xác nhận. 75 cho thấy myrosinase nhạy cảm với nhiệt độ, cho thấy hoạt động của myrosinase bị bất hoạt hoàn toàn khi hạt mù tạt, mù tạt đen và hạt huyết dụ tiếp xúc với nhiệt độ trên 80°C. Những cơ chế này có thể dẫn đến mất hoạt tính diệt côn trùng của bột hạt DFP đã xử lý bằng nhiệt.
Do đó, bột hạt mù tạt và ba loại isothiocyanate chính của nó có độc tính đối với ấu trùng muỗi. Do những khác biệt này giữa bột hạt và phương pháp xử lý hóa học, việc sử dụng bột hạt có thể là một phương pháp diệt muỗi hiệu quả. Cần phải xác định các công thức phù hợp và hệ thống phân phối hiệu quả để cải thiện hiệu quả và tính ổn định của việc sử dụng bột hạt. Kết quả của chúng tôi cho thấy tiềm năng sử dụng bột hạt mù tạt như một giải pháp thay thế cho thuốc trừ sâu tổng hợp. Công nghệ này có thể trở thành một công cụ tiên tiến để kiểm soát các vật trung gian truyền bệnh muỗi. Do ấu trùng muỗi phát triển mạnh trong môi trường nước và glucosinolate trong bột hạt được chuyển hóa nhờ enzyme thành isothiocyanate hoạt động khi ngậm nước, việc sử dụng bột hạt mù tạt trong nước có muỗi mang lại tiềm năng kiểm soát đáng kể. Mặc dù hoạt tính diệt ấu trùng của isothiocyanate khác nhau (BITC > AITC > 4-HBITC), cần nghiên cứu thêm để xác định xem việc kết hợp bột hạt với nhiều loại glucosinolate có làm tăng độc tính một cách hiệp đồng hay không. Đây là nghiên cứu đầu tiên chứng minh tác dụng diệt côn trùng của bột hạt họ cải đã tách béo và ba loại isothiocyanate có hoạt tính sinh học đối với muỗi. Kết quả nghiên cứu này mở ra một hướng đi mới khi chứng minh rằng bột hạt bắp cải đã tách béo, một sản phẩm phụ của quá trình chiết xuất dầu từ hạt, có thể đóng vai trò là một tác nhân diệt ấu trùng đầy hứa hẹn để kiểm soát muỗi. Thông tin này có thể góp phần thúc đẩy việc khám phá các tác nhân kiểm soát sinh học thực vật và phát triển chúng thành thuốc trừ sâu sinh học giá rẻ, thiết thực và thân thiện với môi trường.
Các tập dữ liệu được tạo ra cho nghiên cứu này và các phân tích kết quả có thể được cung cấp từ tác giả liên hệ theo yêu cầu hợp lý. Khi kết thúc nghiên cứu, tất cả vật liệu được sử dụng (côn trùng và bột hạt) đều đã bị tiêu hủy.
Thời gian đăng: 29-07-2024