Hoạt tính sinh học của bột hạt bắp cải và các hợp chất của nó như một chất diệt ấu trùng muỗi thân thiện với môi trường.

Để đạt hiệu quảkiểm soát muỗiĐể giảm tỷ lệ mắc các bệnh do chúng mang theo, cần có các giải pháp thay thế chiến lược, bền vững và thân thiện với môi trường cho thuốc trừ sâu hóa học. Chúng tôi đã đánh giá bột hạt từ một số loài thuộc họ Brassicaceae (họ Brassica) như một nguồn isothiocyanat có nguồn gốc thực vật được tạo ra bằng phương pháp thủy phân enzym các glucosinolate không hoạt tính sinh học để sử dụng trong việc kiểm soát muỗi Aedes Ai Cập (L., 1762). Bột hạt năm loại đã tách dầu (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 và Thlaspi arvense – ba loại chính của sản phẩm hóa học bị bất hoạt nhiệt và phân hủy enzym. Xác định độc tính (LC50) của allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate và 4-hydroxybenzylisothiocyanate đối với ấu trùng muỗi Aedes aegypti sau 24 giờ tiếp xúc = 0,04 g/120 ml dH2O). Giá trị LC50 cho mù tạt, mù tạt trắng và cỏ đuôi ngựa. Bột hạt có giá trị LC50 lần lượt là 0,05, 0,08 và 0,05 so với allyl isothiocyanate (LC50 = 19,35 ppm) và 4-Hydroxybenzylisothiocyanate (LC50 = 55,41 ppm) độc hại hơn đối với ấu trùng sau 24 giờ xử lý so với 0,1 g/120 ml dH2O. Những kết quả này phù hợp với quá trình sản xuất bột hạt cỏ linh lăng. Hiệu quả cao hơn của các este benzyl tương ứng với các giá trị LC50 được tính toán. Sử dụng bột hạt có thể cung cấp một phương pháp kiểm soát muỗi hiệu quả. Hiệu quả của bột hạt họ cải và các thành phần hóa học chính của nó đối với ấu trùng muỗi cho thấy các hợp chất tự nhiên trong bột hạt họ cải có thể đóng vai trò là thuốc diệt ấu trùng thân thiện với môi trường đầy hứa hẹn để kiểm soát muỗi.
Các bệnh do muỗi Aedes truyền vẫn là một vấn đề sức khỏe cộng đồng toàn cầu nghiêm trọng. Tỷ lệ mắc các bệnh do muỗi truyền lan rộng về mặt địa lý1,2,3 và tái xuất hiện, dẫn đến các đợt bùng phát bệnh nặng4,5,6,7. Sự lây lan của các bệnh giữa người và động vật (ví dụ: chikungunya, sốt xuất huyết, sốt thung lũng Rift, sốt vàng da và virus Zika) là chưa từng có. Chỉ riêng sốt xuất huyết đã khiến khoảng 3,6 tỷ người ở vùng nhiệt đới có nguy cơ nhiễm bệnh, với ước tính 390 triệu ca nhiễm bệnh mỗi năm, dẫn đến 6.100–24.300 ca tử vong mỗi năm8. Sự tái xuất hiện và bùng phát của virus Zika ở Nam Mỹ đã thu hút sự chú ý trên toàn thế giới do những tổn thương não mà nó gây ra ở trẻ em sinh ra từ phụ nữ bị nhiễm bệnh2. Kremer và cộng sự3 dự đoán rằng phạm vi địa lý của muỗi Aedes sẽ tiếp tục mở rộng và đến năm 2050, một nửa dân số thế giới sẽ có nguy cơ nhiễm các loại arbovirus do muỗi truyền.
Ngoại trừ các loại vắc-xin mới được phát triển gần đây chống lại bệnh sốt xuất huyết và sốt vàng da, vắc-xin chống lại hầu hết các bệnh do muỗi truyền vẫn chưa được phát triển9,10,11. Vắc-xin hiện vẫn có sẵn với số lượng hạn chế và chỉ được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng. Kiểm soát vật trung gian truyền bệnh là muỗi bằng thuốc trừ sâu tổng hợp là một chiến lược quan trọng để kiểm soát sự lây lan của các bệnh do muỗi truyền12,13. Mặc dù thuốc trừ sâu tổng hợp có hiệu quả trong việc tiêu diệt muỗi, nhưng việc tiếp tục sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp lại ảnh hưởng tiêu cực đến các sinh vật không phải mục tiêu và gây ô nhiễm môi trường14,15,16. Thậm chí đáng báo động hơn là xu hướng gia tăng khả năng kháng thuốc trừ sâu hóa học của muỗi17,18,19. Những vấn đề liên quan đến thuốc trừ sâu này đã thúc đẩy việc tìm kiếm các giải pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với môi trường để kiểm soát vật trung gian truyền bệnh.
Nhiều loại thực vật đã được phát triển làm nguồn thuốc trừ sâu thực vật để kiểm soát dịch hại20,21. Các chất thực vật nói chung thân thiện với môi trường vì chúng có thể phân hủy sinh học và có độc tính thấp hoặc không đáng kể đối với các sinh vật không phải mục tiêu như động vật có vú, cá và động vật lưỡng cư20,22. Các chế phẩm thảo dược được biết đến là tạo ra nhiều hợp chất hoạt tính sinh học với các cơ chế tác động khác nhau để kiểm soát hiệu quả các giai đoạn sống khác nhau của muỗi23,24,25,26. Các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật như tinh dầu và các thành phần hoạt tính thực vật khác đã thu hút sự chú ý và mở đường cho các công cụ đổi mới để kiểm soát vật trung gian truyền bệnh là muỗi. Tinh dầu, monoterpen và sesquiterpen hoạt động như chất xua đuổi, chất ngăn cản ăn và chất diệt trứng27,28,29,30,31,32,33. Nhiều loại dầu thực vật gây chết ấu trùng, nhộng và muỗi trưởng thành34,35,36, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, hô hấp, nội tiết và các hệ thống quan trọng khác của côn trùng37.
Các nghiên cứu gần đây đã cung cấp những hiểu biết sâu sắc về tiềm năng sử dụng cây mù tạt và hạt của chúng như một nguồn hợp chất hoạt tính sinh học. Bột hạt mù tạt đã được thử nghiệm như một chất xông hơi sinh học38,39,40,41 và được sử dụng như một chất cải tạo đất để ngăn chặn cỏ dại42,43,44 và kiểm soát các tác nhân gây bệnh thực vật trong đất45,46,47,48,49,50, dinh dưỡng thực vật, tuyến trùng41,51, 52, 53, 54 và sâu bệnh55, 56, 57, 58, 59, 60. Hoạt tính diệt nấm của các loại bột hạt này được cho là do các hợp chất bảo vệ thực vật gọi là isothiocyanates38,42,60. Trong thực vật, các hợp chất bảo vệ này được lưu trữ trong tế bào thực vật dưới dạng glucosinolate không hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, khi thực vật bị hư hại do côn trùng ăn hoặc nhiễm mầm bệnh, glucosinolate sẽ bị thủy phân bởi myrosinase thành isothiocyanates hoạt tính sinh học55,61. Isothiocyanat là các hợp chất dễ bay hơi được biết đến với hoạt tính kháng khuẩn và diệt côn trùng phổ rộng, và cấu trúc, hoạt tính sinh học và hàm lượng của chúng rất khác nhau giữa các loài thuộc họ Brassicaceae42,59,62,63.
Mặc dù các isothiocyanat có nguồn gốc từ bột hạt mù tạt được biết là có hoạt tính diệt côn trùng, nhưng dữ liệu về hoạt tính sinh học chống lại các loài động vật chân đốt truyền bệnh quan trọng về mặt y học còn thiếu. Nghiên cứu của chúng tôi đã kiểm tra hoạt tính diệt ấu trùng của bốn loại bột hạt đã tách dầu đối với muỗi Aedes. Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá tiềm năng sử dụng chúng như thuốc trừ sâu sinh học thân thiện với môi trường để kiểm soát muỗi. Ba thành phần hóa học chính của bột hạt, allyl isothiocyanat (AITC), benzyl isothiocyanat (BITC) và 4-hydroxybenzylisothiocyanat (4-HBITC) cũng được thử nghiệm để kiểm tra hoạt tính sinh học của các thành phần hóa học này trên ấu trùng muỗi. Đây là báo cáo đầu tiên đánh giá hiệu quả của bốn loại bột hạt cải bắp và các thành phần hóa học chính của chúng đối với ấu trùng muỗi.
Các quần thể muỗi Aedes aegypti (chủng Rockefeller) trong phòng thí nghiệm được duy trì ở nhiệt độ 26°C, độ ẩm tương đối 70% (RH) và chu kỳ chiếu sáng 10:14 giờ (sáng:tối). Muỗi cái đã giao phối được nuôi trong lồng nhựa (cao 11 cm và đường kính 9,5 cm) và được cho ăn bằng hệ thống cho ăn bằng bình sử dụng máu bò đã được citrate hóa (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). Việc cho ăn máu được thực hiện như thường lệ bằng cách sử dụng một bình cho ăn đa ngăn bằng thủy tinh có màng lọc (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) được kết nối với ống bể nước tuần hoàn (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) với nhiệt độ được kiểm soát ở mức 37°C. Trải một lớp màng Parafilm M lên đáy của mỗi ngăn chứa thức ăn bằng thủy tinh (diện tích 154 mm2). Sau đó, mỗi bình cho ăn được đặt trên lưới phía trên che phủ lồng chứa muỗi cái đang giao phối. Khoảng 350–400 μl máu bò được thêm vào phễu cho ăn bằng thủy tinh bằng ống nhỏ giọt Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) và để cho giun trưởng thành ráo nước trong ít nhất một giờ. Giun cái mang thai sau đó được cho uống dung dịch sucrose 10% và được phép đẻ trứng trên giấy lọc ẩm lót trong các cốc soufflé siêu trong suốt riêng lẻ (dung tích 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Đặt giấy lọc chứa trứng vào túi kín (SC Johnsons, Racine, WI) và bảo quản ở 26°C. Trứng được ấp nở và khoảng 200–250 ấu trùng được nuôi trong khay nhựa chứa hỗn hợp thức ăn cho thỏ (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) và bột gan (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). và phi lê cá (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Đức) theo tỷ lệ 2:1:1. Ấu trùng giai đoạn cuối thứ ba được sử dụng trong các thí nghiệm sinh học của chúng tôi.
Vật liệu hạt giống thực vật được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ các nguồn thương mại và chính phủ sau: Brassica juncea (mù tạt nâu - Pacific Gold) và Brassica juncea (mù tạt trắng - Ida Gold) từ Hợp tác xã Nông dân Tây Bắc Thái Bình Dương, bang Washington, Hoa Kỳ; (Cải xoong vườn) từ Công ty Kelly Seed and Hardware, Peoria, IL, Hoa Kỳ và Thlaspi arvense (Cải xoong đồng ruộng - Elisabeth) từ USDA-ARS, Peoria, IL, Hoa Kỳ; Không có hạt giống nào được sử dụng trong nghiên cứu này được xử lý bằng thuốc trừ sâu. Tất cả vật liệu hạt giống đều được chế biến và sử dụng trong nghiên cứu này theo đúng quy định địa phương và quốc gia, cũng như tuân thủ tất cả các quy định liên quan của địa phương, tiểu bang và quốc gia. Nghiên cứu này không xem xét các giống cây trồng biến đổi gen.
Hạt cải bắp (Brassica juncea - PG), cỏ linh lăng (Alfalfa - Ls), mù tạt trắng (White mustard - IG), và cỏ đuôi ngựa (Thlaspi arvense - DFP) được nghiền thành bột mịn bằng máy nghiền ly tâm siêu tốc Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Đức) được trang bị lưới lọc 0,75 mm và rôto bằng thép không gỉ, 12 răng, tốc độ 10.000 vòng/phút (Bảng 1). Bột hạt đã nghiền được chuyển vào ống giấy và khử chất béo bằng hexane trong thiết bị Soxhlet trong 24 giờ. Một mẫu phụ của mù tạt đã khử chất béo được xử lý nhiệt ở 100 °C trong 1 giờ để làm biến tính myrosinase và ngăn chặn sự thủy phân glucosinolate tạo thành isothiocyanate hoạt tính sinh học. Bột hạt cỏ đuôi ngựa đã xử lý nhiệt (DFP-HT) được sử dụng làm đối chứng âm bằng cách làm biến tính myrosinase.
Hàm lượng glucosinolate trong bột hạt đã tách dầu được xác định ba lần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo một quy trình đã được công bố trước đó 64. Tóm lại, 3 mL methanol được thêm vào mẫu 250 mg bột hạt đã tách dầu. Mỗi mẫu được siêu âm trong bể nước trong 30 phút và để trong bóng tối ở 23°C trong 16 giờ. Sau đó, 1 mL phần dung dịch hữu cơ được lọc qua màng lọc 0,45 μm vào bộ lấy mẫu tự động. Chạy trên hệ thống HPLC Shimadzu (hai bơm LC 20AD; bộ lấy mẫu tự động SIL 20A; bộ khử khí DGU 20As; đầu dò UV-VIS SPD-20A để theo dõi ở bước sóng 237 nm; và mô-đun bus truyền thông CBM-20A), hàm lượng glucosinolate trong bột hạt được xác định ba lần bằng phần mềm Shimadzu LC Solution phiên bản 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Cột sắc ký là cột pha đảo C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Điều kiện pha động ban đầu được thiết lập ở 12% methanol/88% dung dịch tetrabutylammonium hydroxide 0,01 M trong nước (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) với tốc độ dòng chảy 1 mL/min. Sau khi tiêm 15 μl mẫu, các điều kiện ban đầu được duy trì trong 20 phút, sau đó tỷ lệ dung môi được điều chỉnh thành 100% methanol, với tổng thời gian phân tích mẫu là 65 phút. Đường cong chuẩn (dựa trên nM/mAb) được tạo ra bằng cách pha loãng nối tiếp các chất chuẩn sinapine, glucosinolate và myrosin mới pha (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) để ước tính hàm lượng lưu huỳnh trong bột hạt đã tách dầu. Nồng độ glucosinolate trong các mẫu được kiểm tra trên hệ thống HPLC Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) sử dụng phần mềm OpenLAB CDS ChemStation phiên bản (C.01.07 SR2 [255]) được trang bị cùng một cột và sử dụng phương pháp đã được mô tả trước đó. Nồng độ glucosinolate được xác định; có thể so sánh được giữa các hệ thống HPLC.
Allyl isothiocyanate (94%, ổn định) và benzyl isothiocyanate (98%) được mua từ Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-Hydroxybenzylisothiocyanate được mua từ ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Khi bị thủy phân bằng enzym myrosinase, glucosinolate, glucosinolate và glucosinolate tạo thành allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate và 4-hydroxybenzylisothiocyanate tương ứng.
Các thử nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Muturi et al. 32 với một số sửa đổi. Năm loại thức ăn hạt ít chất béo đã được sử dụng trong nghiên cứu: DFP, DFP-HT, IG, PG và Ls. Hai mươi ấu trùng được đặt trong cốc ba chiều dùng một lần 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) chứa 120 mL nước khử ion (dH2O). Bảy nồng độ bột hạt đã được thử nghiệm về độc tính đối với ấu trùng muỗi: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 và 0,12 g bột hạt/120 ml dH2O đối với bột hạt DFP, DFP-HT, IG và PG. Các thử nghiệm sinh học sơ bộ cho thấy bột hạt Ls đã tách chất béo độc hơn bốn loại bột hạt khác được thử nghiệm. Do đó, chúng tôi đã điều chỉnh bảy nồng độ xử lý bột hạt Ls thành các nồng độ sau: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 và 0,075 g/120 mL dH2O.
Một nhóm đối chứng không được xử lý (nước cất, không bổ sung bột hạt) được đưa vào để đánh giá tỷ lệ tử vong bình thường của côn trùng trong điều kiện thí nghiệm. Thí nghiệm độc tính sinh học đối với mỗi loại bột hạt bao gồm ba cốc thủy tinh ba dốc lặp lại (20 ấu trùng giai đoạn cuối instar thứ ba mỗi cốc), tổng cộng 108 lọ. Các vật chứa được xử lý được bảo quản ở nhiệt độ phòng (20-21°C) và tỷ lệ tử vong của ấu trùng được ghi nhận trong 24 và 72 giờ tiếp xúc liên tục với nồng độ xử lý. Nếu cơ thể và các phần phụ của muỗi không cử động khi bị chọc thủng hoặc chạm vào bằng một chiếc thìa thép không gỉ mỏng, ấu trùng muỗi được coi là đã chết. Ấu trùng chết thường nằm bất động ở vị trí lưng hoặc bụng ở đáy vật chứa hoặc trên mặt nước. Thí nghiệm được lặp lại ba lần vào các ngày khác nhau bằng cách sử dụng các nhóm ấu trùng khác nhau, tổng cộng 180 ấu trùng tiếp xúc với mỗi nồng độ xử lý.
Độ độc của AITC, BITC và 4-HBITC đối với ấu trùng muỗi được đánh giá bằng cùng một quy trình thử nghiệm sinh học nhưng với các phương pháp xử lý khác nhau. Chuẩn bị dung dịch gốc 100.000 ppm cho mỗi hóa chất bằng cách thêm 100 µL hóa chất vào 900 µL etanol tuyệt đối trong ống ly tâm 2 mL và lắc trong 30 giây để trộn đều. Nồng độ xử lý được xác định dựa trên các thử nghiệm sinh học sơ bộ của chúng tôi, cho thấy BITC độc hơn nhiều so với AITC và 4-HBITC. Để xác định độc tính, đã sử dụng 5 nồng độ BITC (1, 3, 6, 9 và 12 ppm), 7 nồng độ AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 và 35 ppm) và 6 nồng độ 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 và 35 ppm). (30, 45, 60, 75 và 90 ppm). Phương pháp điều trị đối chứng được tiêm 108 μL ethanol tuyệt đối, tương đương với thể tích tối đa của phương pháp điều trị hóa học. Các thí nghiệm sinh học được lặp lại như trên, với tổng cộng 180 ấu trùng được tiếp xúc với mỗi nồng độ điều trị. Tỷ lệ tử vong của ấu trùng được ghi nhận cho mỗi nồng độ AITC, BITC và 4-HBITC sau 24 giờ tiếp xúc liên tục.
Phân tích Probit của 65 dữ liệu tử vong liên quan đến liều lượng được thực hiện bằng phần mềm Polo (Polo Plus, LeOra Software, phiên bản 1.0) để tính toán nồng độ gây chết 50% (LC50), nồng độ gây chết 90% (LC90), độ dốc, hệ số liều gây chết và nồng độ gây chết 95% dựa trên khoảng tin cậy cho tỷ lệ liều gây chết đối với nồng độ được chuyển đổi logarit và đường cong liều lượng-tử vong. Dữ liệu tử vong dựa trên dữ liệu lặp lại kết hợp của 180 ấu trùng tiếp xúc với mỗi nồng độ xử lý. Phân tích xác suất được thực hiện riêng cho từng loại bột hạt và từng thành phần hóa học. Dựa trên khoảng tin cậy 95% của tỷ lệ liều gây chết, độc tính của bột hạt và các thành phần hóa học đối với ấu trùng muỗi được coi là khác biệt đáng kể, do đó khoảng tin cậy chứa giá trị 1 không khác biệt đáng kể, P = 0,0566.
Kết quả phân tích HPLC để xác định các glucosinolate chính trong bột hạt đã tách dầu DFP, IG, PG và Ls được liệt kê trong Bảng 1. Các glucosinolate chính trong bột hạt được thử nghiệm có sự khác biệt, ngoại trừ DFP và PG, cả hai đều chứa glucosinolate myrosinase. Hàm lượng myrosinin trong PG cao hơn trong DFP, lần lượt là 33,3 ± 1,5 và 26,5 ± 0,9 mg/g. Bột hạt Ls chứa 36,6 ± 1,2 mg/g glucoglycone, trong khi bột hạt IG chứa 38,0 ± 0,5 mg/g sinapine.
Ấu trùng muỗi Ae. Aedes aegypti bị tiêu diệt khi được xử lý bằng bột hạt đã tách dầu, mặc dù hiệu quả của phương pháp điều trị thay đổi tùy thuộc vào loài thực vật. Chỉ có DFP-NT là không độc hại đối với ấu trùng muỗi sau 24 và 72 giờ tiếp xúc (Bảng 2). Độ độc của bột hạt hoạt tính tăng lên khi nồng độ tăng (Hình 1A, B). Độ độc của bột hạt đối với ấu trùng muỗi thay đổi đáng kể dựa trên khoảng tin cậy 95% của tỷ lệ liều gây chết LC50 ở các đánh giá 24 giờ và 72 giờ (Bảng 3). Sau 24 giờ, tác dụng độc hại của bột hạt Ls lớn hơn các phương pháp xử lý bột hạt khác, với hoạt tính cao nhất và độc tính tối đa đối với ấu trùng (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Ấu trùng ít nhạy cảm với DFP hơn sau 24 giờ so với các phương pháp xử lý bằng bột hạt IG, Ls và PG, với giá trị LC50 lần lượt là 0,115, 0,04 và 0,08 g/120 ml dH2O, cao hơn đáng kể so với giá trị LC50 là 0,211 g/120 ml dH2O (Bảng 3). Giá trị LC90 của DFP, IG, PG và Ls lần lượt là 0,376, 0,275, 0,137 và 0,074 g/120 ml dH2O (Bảng 2). Nồng độ DPP cao nhất là 0,12 g/120 ml dH2O. Sau 24 giờ đánh giá, tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng chỉ là 12%, trong khi tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng IG và PG lần lượt đạt 51% và 82%. Sau 24 giờ đánh giá, tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng đối với nghiệm thức sử dụng bột hạt Ls ở nồng độ cao nhất (0,075 g/120 ml dH2O) là 99% (Hình 1A).
Đường cong tỷ lệ tử vong được ước tính từ đáp ứng liều (Probit) của ấu trùng muỗi Ae. Ai Cập (ấu trùng giai đoạn 3) với nồng độ bột hạt sau 24 giờ (A) và 72 giờ (B) xử lý. Đường chấm chấm biểu thị LC50 của phương pháp xử lý bằng bột hạt. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense bất hoạt bằng nhiệt, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Sau 72 giờ đánh giá, giá trị LC50 của bột hạt DFP, IG và PG lần lượt là 0,111, 0,085 và 0,051 g/120 ml dH2O. Hầu hết ấu trùng tiếp xúc với bột hạt Ls đều chết sau 72 giờ tiếp xúc, do đó dữ liệu về tỷ lệ tử vong không nhất quán với phân tích Probit. So với các loại bột hạt khác, ấu trùng ít nhạy cảm hơn với bột hạt DFP và có giá trị LC50 cao hơn đáng kể về mặt thống kê (Bảng 2 và 3). Sau 72 giờ, giá trị LC50 của bột hạt DFP, IG và PG được ước tính lần lượt là 0,111, 0,085 và 0,05 g/120 ml dH2O. Sau 72 giờ đánh giá, giá trị LC90 của bột hạt DFP, IG và PG lần lượt là 0,215, 0,254 và 0,138 g/120 ml dH2O. Sau 72 giờ đánh giá, tỷ lệ tử vong trung bình của ấu trùng đối với các nghiệm thức bột hạt DFP, IG và PG ở nồng độ tối đa 0,12 g/120 ml dH2O lần lượt là 58%, 66% và 96% (Hình 1B). Sau 72 giờ đánh giá, bột hạt PG được phát hiện độc hại hơn bột hạt IG và DFP.
Các isothiocyanat tổng hợp, allyl isothiocyanat (AITC), benzyl isothiocyanat (BITC) và 4-hydroxybenzylisothiocyanat (4-HBITC) có thể tiêu diệt ấu trùng muỗi hiệu quả. Sau 24 giờ xử lý, BITC độc hại hơn đối với ấu trùng với giá trị LC50 là 5,29 ppm so với 19,35 ppm của AITC và 55,41 ppm của 4-HBITC (Bảng 4). So với AITC và BITC, 4-HBITC có độc tính thấp hơn và giá trị LC50 cao hơn. Có sự khác biệt đáng kể về độc tính đối với ấu trùng muỗi của hai isothiocyanat chính (Ls và PG) trong bột hạt có hiệu lực cao nhất. Độ độc dựa trên tỷ lệ liều gây chết LC50 giữa AITC, BITC và 4-HBITC cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, trong đó khoảng tin cậy 95% của tỷ lệ liều gây chết LC50 không bao gồm giá trị 1 (P = 0,05, Bảng 4). Nồng độ cao nhất của cả BITC và AITC được ước tính có thể tiêu diệt 100% ấu trùng được thử nghiệm (Hình 2).
Đường cong tỷ lệ tử vong được ước tính từ đáp ứng liều (Probit) của Ae. 24 giờ sau khi xử lý, ấu trùng Ai Cập (ấu trùng giai đoạn 3) đạt đến nồng độ isothiocyanate tổng hợp. Đường chấm chấm biểu thị LC50 đối với xử lý bằng isothiocyanate. Benzyl isothiocyanate BITC, allyl isothiocyanate AITC và 4-HBITC.
Việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học từ thực vật làm tác nhân kiểm soát muỗi đã được nghiên cứu từ lâu. Nhiều loại thực vật sản sinh ra các chất hóa học tự nhiên có hoạt tính diệt côn trùng37. Các hợp chất hoạt tính sinh học của chúng cung cấp một giải pháp thay thế hấp dẫn cho thuốc trừ sâu tổng hợp với tiềm năng lớn trong việc kiểm soát sâu bệnh, bao gồm cả muỗi.
Cây mù tạt được trồng để lấy hạt, dùng làm gia vị và nguồn dầu. Khi dầu mù tạt được chiết xuất từ ​​hạt hoặc khi mù tạt được chiết xuất để sử dụng làm nhiên liệu sinh học, sản phẩm phụ thu được là bột hạt đã tách dầu. Bột hạt này vẫn giữ lại nhiều thành phần sinh hóa tự nhiên và enzyme thủy phân. Tính độc hại của bột hạt này được cho là do sự sản sinh ra isothiocyanates55,60,61. Isothiocyanates được hình thành do quá trình thủy phân glucosinolates bởi enzyme myrosinase trong quá trình hydrat hóa bột hạt38,55,70 và được biết là có tác dụng diệt nấm, diệt khuẩn, diệt tuyến trùng và diệt côn trùng, cũng như các đặc tính khác bao gồm tác dụng cảm quan hóa học và đặc tính trị liệu hóa học61,62,70. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây mù tạt và bột hạt có tác dụng xông hơi hiệu quả chống lại sâu bệnh hại đất và thực phẩm dự trữ57,59,71,72. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá độc tính của bột hạt cải dầu và ba sản phẩm hoạt tính sinh học của nó là AITC, BITC và 4-HBITC đối với ấu trùng muỗi Aedes (Aedes aegypti). Việc thêm trực tiếp bột hạt vào nước có chứa ấu trùng muỗi được cho là sẽ kích hoạt các quá trình enzyme tạo ra isothiocyanat, chất độc hại đối với ấu trùng muỗi. Sự biến đổi sinh học này đã được chứng minh một phần bằng hoạt tính diệt ấu trùng của bột hạt và sự mất hoạt tính diệt côn trùng khi bột hạt cải dầu được xử lý nhiệt trước khi sử dụng. Xử lý nhiệt được cho là sẽ phá hủy các enzyme thủy phân kích hoạt glucosinolate, do đó ngăn chặn sự hình thành isothiocyanat hoạt tính sinh học. Đây là nghiên cứu đầu tiên xác nhận đặc tính diệt côn trùng của bột hạt cải dầu đối với muỗi trong môi trường nước.
Trong số các loại bột hạt được thử nghiệm, bột hạt cải xoong (Ls) là độc nhất, gây tỷ lệ tử vong cao ở muỗi Aedes albopictus. Ấu trùng muỗi Aedes aegypti được xử lý liên tục trong 24 giờ. Ba loại bột hạt còn lại (PG, IG và DFP) có hoạt tính chậm hơn nhưng vẫn gây tỷ lệ tử vong đáng kể sau 72 giờ xử lý liên tục. Chỉ có bột hạt Ls chứa lượng glucosinolate đáng kể, trong khi PG và DFP chứa myrosinase và IG chứa glucosinolate là glucosinolate chính (Bảng 1). Glucotropaeolin được thủy phân thành BITC và sinalbine được thủy phân thành 4-HBITC61,62. Kết quả thử nghiệm sinh học của chúng tôi cho thấy cả bột hạt Ls và BITC tổng hợp đều rất độc đối với ấu trùng muỗi. Thành phần chính của bột hạt PG và DFP là myrosinase glucosinolate, được thủy phân thành AITC. AITC có hiệu quả trong việc tiêu diệt ấu trùng muỗi với giá trị LC50 là 19,35 ppm. So với AITC và BITC, 4-HBITC isothiocyanate ít độc hại nhất đối với ấu trùng. Mặc dù AITC ít độc hại hơn BITC, nhưng giá trị LC50 của chúng thấp hơn nhiều loại tinh dầu được thử nghiệm trên ấu trùng muỗi32,73,74,75.
Bột hạt họ cải của chúng tôi dùng để diệt ấu trùng muỗi chứa một glucosinolate chính, chiếm hơn 98-99% tổng lượng glucosinolate được xác định bằng HPLC. Một lượng nhỏ các glucosinolate khác được phát hiện, nhưng hàm lượng của chúng thấp hơn 0,3% tổng lượng glucosinolate. Bột hạt cải xoong (L. sativum) chứa glucosinolate thứ cấp (sinigrin), nhưng tỷ lệ của chúng chỉ chiếm 1% tổng lượng glucosinolate, và hàm lượng của chúng vẫn không đáng kể (khoảng 0,4 mg/g bột hạt). Mặc dù PG và DFP chứa cùng một glucosinolate chính (myrosin), nhưng hoạt tính diệt ấu trùng của bột hạt của chúng khác nhau đáng kể do giá trị LC50 của chúng. Độ độc đối với bệnh phấn trắng cũng khác nhau. Sự xuất hiện của ấu trùng muỗi Aedes aegypti có thể là do sự khác biệt về hoạt tính hoặc độ ổn định của myrosinase giữa hai loại thức ăn từ hạt. Hoạt tính của myrosinase đóng vai trò quan trọng trong khả năng sinh học của các sản phẩm thủy phân như isothiocyanates trong cây họ Brassicaceae76. Các báo cáo trước đây của Pocock et al.77 và Wilkinson et al.78 đã chỉ ra rằng những thay đổi về hoạt động và độ ổn định của myrosinase cũng có thể liên quan đến các yếu tố di truyền và môi trường.
Hàm lượng isothiocyanat hoạt tính sinh học dự kiến ​​được tính toán dựa trên giá trị LC50 của từng loại bột hạt ở 24 và 72 giờ (Bảng 5) để so sánh với các ứng dụng hóa chất tương ứng. Sau 24 giờ, isothiocyanat trong bột hạt độc hơn so với các hợp chất tinh khiết. Giá trị LC50 được tính toán dựa trên phần triệu (ppm) của isothiocyanat trong các phương pháp xử lý hạt thấp hơn giá trị LC50 đối với các ứng dụng BITC, AITC và 4-HBITC. Chúng tôi quan sát thấy ấu trùng ăn các viên bột hạt (Hình 3A). Do đó, ấu trùng có thể tiếp xúc với isothiocyanat độc hại ở nồng độ cao hơn bằng cách ăn các viên bột hạt. Điều này thể hiện rõ nhất trong các phương pháp xử lý bột hạt IG và PG sau 24 giờ tiếp xúc, trong đó nồng độ LC50 thấp hơn lần lượt 75% và 72% so với các phương pháp xử lý AITC và 4-HBITC tinh khiết. Các phương pháp xử lý bằng Ls và DFP độc hại hơn isothiocyanate nguyên chất, với giá trị LC50 thấp hơn lần lượt là 24% và 41%. Ấu trùng trong nhóm đối chứng đã hóa nhộng thành công (Hình 3B), trong khi hầu hết ấu trùng trong nhóm xử lý bằng bột hạt không hóa nhộng và sự phát triển của ấu trùng bị chậm lại đáng kể (Hình 3B, D). Ở Spodopteralitura, isothiocyanates có liên quan đến sự chậm phát triển và trì trệ quá trình phát triển79.
Ấu trùng muỗi Ae. Aedes aegypti được tiếp xúc liên tục với bột hạt cải dầu trong 24–72 giờ. (A) Ấu trùng chết với các hạt bột trong bộ phận miệng (khoanh tròn); (B) Xử lý đối chứng (nước cất không thêm bột hạt) cho thấy ấu trùng phát triển bình thường và bắt đầu hóa nhộng sau 72 giờ; (C, D) Ấu trùng được xử lý bằng bột hạt; bột hạt cho thấy sự khác biệt trong quá trình phát triển và không hóa nhộng.
Chúng tôi chưa nghiên cứu cơ chế tác động độc hại của isothiocyanat đối với ấu trùng muỗi. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây trên kiến ​​lửa đỏ (Solenopsis invicta) đã chỉ ra rằng ức chế glutathione S-transferase (GST) và esterase (EST) là cơ chế chính của hoạt tính sinh học của isothiocyanat, và AITC, ngay cả ở hoạt tính thấp, cũng có thể ức chế hoạt động của GST ở kiến ​​lửa đỏ nhập khẩu ở nồng độ thấp. Liều lượng là 0,5 µg/ml80. Ngược lại, AITC ức chế acetylcholinesterase ở mọt ngô trưởng thành (Sitophilus zeamais)81. Cần tiến hành các nghiên cứu tương tự để làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của isothiocyanat ở ấu trùng muỗi.
Chúng tôi sử dụng phương pháp xử lý DFP bất hoạt bằng nhiệt để hỗ trợ đề xuất rằng quá trình thủy phân glucosinolate thực vật để tạo thành isothiocyanate phản ứng đóng vai trò là cơ chế kiểm soát ấu trùng muỗi bằng bột hạt mù tạt. Bột hạt DFP-HT không độc hại ở các liều lượng ứng dụng đã thử nghiệm. Lafarga et al. 82 báo cáo rằng glucosinolate nhạy cảm với sự phân hủy ở nhiệt độ cao. Xử lý nhiệt cũng được cho là sẽ làm biến tính enzyme myrosinase trong bột hạt và ngăn chặn quá trình thủy phân glucosinolate để tạo thành isothiocyanate phản ứng. Điều này cũng được Okunade et al. 75 xác nhận, cho thấy myrosinase nhạy cảm với nhiệt độ, cho thấy hoạt động của myrosinase bị bất hoạt hoàn toàn khi hạt mù tạt, mù tạt đen và huyết căn tiếp xúc với nhiệt độ trên 80°C. Những cơ chế này có thể dẫn đến mất hoạt tính diệt côn trùng của bột hạt DFP được xử lý nhiệt.
Do đó, bột hạt mù tạt và ba isothiocyanat chính của nó có độc tính đối với ấu trùng muỗi. Xét đến những khác biệt giữa bột hạt và các phương pháp xử lý hóa học, việc sử dụng bột hạt có thể là một phương pháp kiểm soát muỗi hiệu quả. Cần phải xác định các công thức phù hợp và hệ thống phân phối hiệu quả để cải thiện hiệu quả và tính ổn định của việc sử dụng bột hạt. Kết quả của chúng tôi cho thấy tiềm năng sử dụng bột hạt mù tạt như một giải pháp thay thế cho thuốc trừ sâu tổng hợp. Công nghệ này có thể trở thành một công cụ đổi mới để kiểm soát các vật trung gian truyền bệnh là muỗi. Bởi vì ấu trùng muỗi phát triển mạnh trong môi trường nước và glucosinolate trong bột hạt được chuyển hóa thành isothiocyanat hoạt tính bằng enzym khi ngậm nước, việc sử dụng bột hạt mù tạt trong nước nhiễm muỗi mang lại tiềm năng kiểm soát đáng kể. Mặc dù hoạt tính diệt ấu trùng của isothiocyanat khác nhau (BITC > AITC > 4-HBITC), cần nghiên cứu thêm để xác định liệu việc kết hợp bột hạt với nhiều glucosinolate có làm tăng độc tính một cách hiệp đồng hay không. Đây là nghiên cứu đầu tiên chứng minh tác dụng diệt côn trùng của bột hạt họ cải đã tách dầu và ba isothiocyanat hoạt tính sinh học đối với muỗi. Kết quả của nghiên cứu này mở ra hướng đi mới bằng cách chỉ ra rằng bột hạt bắp cải đã tách dầu, một sản phẩm phụ của quá trình chiết xuất dầu từ hạt, có thể là một chất diệt ấu trùng đầy hứa hẹn để kiểm soát muỗi. Thông tin này có thể giúp thúc đẩy việc khám phá các tác nhân kiểm soát sinh học thực vật và phát triển chúng thành các loại thuốc trừ sâu sinh học rẻ tiền, thiết thực và thân thiện với môi trường.
Các bộ dữ liệu được tạo ra cho nghiên cứu này và các phân tích kết quả có sẵn từ tác giả liên hệ khi có yêu cầu hợp lý. Sau khi kết thúc nghiên cứu, tất cả các vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu (côn trùng và bột hạt) đã bị tiêu hủy.