Sự kết hợp của các hợp chất terpene dựa trên tinh dầu thực vật như một loại thuốc diệt ấu trùng và trưởng thành chống lại Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản mới hơn của trình duyệt (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng hoặc JavaScript.
Sự kết hợp của các hợp chất diệt côn trùng có nguồn gốc từ thực vật có thể biểu hiện tương tác hiệp đồng hoặc đối kháng chống lại sâu bệnh. Do sự lây lan nhanh chóng của các bệnh do muỗi Aedes mang theo và sự gia tăng sức đề kháng của quần thể muỗi Aedes đối với thuốc trừ sâu truyền thống, hai mươi tám sự kết hợp của các hợp chất terpene dựa trên tinh dầu thực vật đã được xây dựng và thử nghiệm trên các giai đoạn ấu trùng và trưởng thành của muỗi Aedes aegypti. Năm loại tinh dầu thực vật (EO) ban đầu được đánh giá về hiệu quả diệt ấu trùng và hiệu quả sử dụng ở muỗi trưởng thành, và hai hợp chất chính đã được xác định trong mỗi EO dựa trên kết quả GC-MS. Các hợp chất chính được xác định đã được mua, cụ thể là diallyl disulfide, diallyl trisulfide, carvone, limonene, eugenol, methyl eugenol, eucalyptol, eudesmol và muỗi alpha-pinene. Sau đó, các sự kết hợp nhị phân của các hợp chất này được chuẩn bị bằng cách sử dụng liều dưới mức gây chết và các tác dụng hiệp đồng và đối kháng của chúng đã được thử nghiệm và xác định. Các thành phần diệt ấu trùng tốt nhất thu được bằng cách trộn limonene với diallyl disulfide, và các thành phần diệt trưởng thành tốt nhất thu được bằng cách trộn carvone với limonene. Thuốc diệt ấu trùng tổng hợp Temphos được sử dụng trong thương mại và thuốc diệt ấu trùng trưởng thành Malathion đã được thử nghiệm riêng biệt và trong các kết hợp nhị phân với terpenoid. Kết quả cho thấy sự kết hợp của temephos và diallyl disulfide và malathion và eudesmol là sự kết hợp hiệu quả nhất. Những sự kết hợp mạnh mẽ này có tiềm năng sử dụng chống lại Aedes aegypti.
Tinh dầu thực vật (EO) là chất chuyển hóa thứ cấp chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau và ngày càng trở nên quan trọng như một giải pháp thay thế cho thuốc trừ sâu tổng hợp. Chúng không chỉ thân thiện với môi trường và người dùng mà còn là hỗn hợp của nhiều hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau, giúp giảm khả năng phát triển tình trạng kháng thuốc1. Sử dụng công nghệ GC-MS, các nhà nghiên cứu đã kiểm tra các thành phần của nhiều loại tinh dầu thực vật khác nhau và xác định được hơn 3.000 hợp chất từ ​​17.500 loại cây thơm2, hầu hết trong số đó đã được thử nghiệm về đặc tính diệt côn trùng và được báo cáo là có tác dụng diệt côn trùng3,4. Một số nghiên cứu nhấn mạnh rằng độc tính của thành phần chính của hợp chất này tương đương hoặc cao hơn độc tính của etylen oxit thô. Nhưng việc sử dụng từng hợp chất riêng lẻ có thể lại tạo điều kiện cho tình trạng kháng thuốc phát triển, giống như trường hợp của thuốc trừ sâu hóa học5,6. Do đó, trọng tâm hiện nay là chuẩn bị hỗn hợp các hợp chất gốc etylen oxit để cải thiện hiệu quả diệt côn trùng và giảm khả năng kháng thuốc ở các quần thể sâu bệnh mục tiêu. Các hợp chất hoạt tính riêng lẻ có trong EO có thể biểu hiện tác dụng hiệp đồng hoặc đối kháng khi kết hợp phản ánh hoạt động chung của EO, một thực tế đã được nhấn mạnh trong các nghiên cứu do các nhà nghiên cứu trước đây thực hiện7,8. Chương trình kiểm soát vectơ cũng bao gồm EO và các thành phần của nó. Hoạt động diệt muỗi của tinh dầu đã được nghiên cứu rộng rãi trên muỗi Culex và Anopheles. Một số nghiên cứu đã cố gắng phát triển thuốc trừ sâu hiệu quả bằng cách kết hợp nhiều loại cây với thuốc trừ sâu tổng hợp được sử dụng trong thương mại để tăng độc tính tổng thể và giảm thiểu tác dụng phụ9. Nhưng các nghiên cứu về các hợp chất như vậy chống lại Aedes aegypti vẫn còn hiếm. Những tiến bộ trong khoa học y tế và sự phát triển của thuốc và vắc-xin đã giúp chống lại một số bệnh do vectơ truyền. Nhưng sự hiện diện của các huyết thanh nhóm khác nhau của vi-rút, do muỗi Aedes aegypti truyền, đã dẫn đến thất bại của các chương trình tiêm chủng. Do đó, khi các bệnh như vậy xảy ra, các chương trình kiểm soát vectơ là lựa chọn duy nhất để ngăn ngừa sự lây lan của bệnh. Trong bối cảnh hiện tại, việc kiểm soát Aedes aegypti rất quan trọng vì đây là vectơ chính của nhiều loại vi-rút và các huyết thanh gây ra sốt xuất huyết, Zika, sốt xuất huyết Dengue, sốt vàng da, v.v. Điều đáng chú ý nhất là thực tế là số ca mắc hầu hết các bệnh do muỗi truyền qua muỗi Aedes đều tăng lên hàng năm ở Ai Cập và đang gia tăng trên toàn thế giới. Do đó, trong bối cảnh này, việc phát triển các biện pháp kiểm soát hiệu quả và thân thiện với môi trường đối với quần thể muỗi Aedes aegypti là hết sức cấp thiết. Các ứng cử viên tiềm năng trong lĩnh vực này là EO, các hợp chất cấu thành của chúng và sự kết hợp của chúng. Do đó, nghiên cứu này đã cố gắng xác định các kết hợp hiệp đồng hiệu quả của các hợp chất EO thực vật chính từ năm loại cây có đặc tính diệt côn trùng (tức là bạc hà, húng quế, khuynh diệp đốm, Allium sulfur và tràm trà) chống lại Aedes aegypti.
Tất cả các EO được chọn đều cho thấy hoạt động diệt ấu trùng tiềm năng đối với Aedes aegypti với LC50 24 giờ dao động từ 0,42 đến 163,65 ppm. Hoạt động diệt ấu trùng cao nhất được ghi nhận đối với EO bạc hà (Mp) với giá trị LC50 là 0,42 ppm sau 24 giờ, tiếp theo là tỏi (As) với giá trị LC50 là 16,19 ppm sau 24 giờ (Bảng 1).
Ngoại trừ Ocimum Sainttum, Os EO, tất cả bốn EO được sàng lọc khác đều cho thấy tác dụng diệt dị ứng rõ ràng, với giá trị LC50 dao động từ 23,37 đến 120,16 ppm trong thời gian tiếp xúc 24 giờ. Thymophilus striata (Cl) EO có hiệu quả nhất trong việc tiêu diệt những con trưởng thành với giá trị LC50 là 23,37 ppm trong vòng 24 giờ sau khi tiếp xúc, tiếp theo là Eucalyptus maculata (Em) có giá trị LC50 là 101,91 ppm (Bảng 1). Mặt khác, giá trị LC50 đối với Os vẫn chưa được xác định vì tỷ lệ tử vong cao nhất là 53% được ghi nhận ở liều cao nhất (Hình bổ sung 3).
Hai hợp chất thành phần chính trong mỗi EO được xác định và lựa chọn dựa trên kết quả cơ sở dữ liệu thư viện NIST, phần trăm diện tích sắc ký đồ GC và kết quả phổ MS (Bảng 2). Đối với EO As, các hợp chất chính được xác định là diallyl disulfide và diallyl trisulfide; đối với EO Mp, các hợp chất chính được xác định là carvone và limonene, đối với EO Em, các hợp chất chính được xác định là eudesmol và eucalyptol; Đối với EO Os, các hợp chất chính được xác định là eugenol và methyl eugenol, và đối với EO Cl, các hợp chất chính được xác định là eugenol và α-pinene (Hình 1, Hình bổ sung 5–8, Bảng bổ sung 1–5).
Kết quả phổ khối của các terpenoid chính trong một số loại tinh dầu được chọn (A-diallyl disulfide; B-diallyl trisulfide; C-eugenol; D-methyl eugenol; E-limonene; F-aromatic ceperone; G-α-pinene; H-cineole; R-eudamol).
Tổng cộng có chín hợp chất (diallyl disulfide, diallyl trisulfide, eugenol, methyl eugenol, carvone, limonene, eucalyptol, eudesmol, α-pinene) được xác định là các hợp chất hiệu quả là thành phần chính của EO và được thử nghiệm sinh học riêng lẻ đối với Aedes aegypti ở giai đoạn ấu trùng. . Hợp chất eudesmol có hoạt tính diệt ấu trùng cao nhất với giá trị LC50 là 2,25 ppm sau 24 giờ tiếp xúc. Các hợp chất diallyl disulfide và diallyl trisulfide cũng được phát hiện có tác dụng diệt ấu trùng tiềm tàng, với liều dưới mức gây chết trung bình trong khoảng 10–20 ppm. Hoạt tính diệt ấu trùng vừa phải một lần nữa được quan sát thấy đối với các hợp chất eugenol, limonene và eucalyptol với giá trị LC50 là 63,35 ppm, 139,29 ppm. và 181,33 ppm sau 24 giờ (Bảng 3). Tuy nhiên, không tìm thấy tiềm năng diệt ấu trùng đáng kể nào của methyl eugenol và carvone ngay cả ở liều cao nhất, do đó không tính được giá trị LC50 (Bảng 3). Thuốc diệt ấu trùng tổng hợp Temephos có nồng độ gây chết trung bình là 0,43 ppm đối với Aedes aegypti trong hơn 24 giờ tiếp xúc (Bảng 3, Bảng bổ sung 6).
Bảy hợp chất (diallyl disulfide, diallyl trisulfide, eucalyptol, α-pinene, eudesmol, limonene và carvone) đã được xác định là các hợp chất chính của EO hiệu quả và đã được thử nghiệm riêng lẻ trên muỗi Aedes Ai Cập trưởng thành. Theo phân tích hồi quy Probit, Eudesmol được phát hiện có tiềm năng cao nhất với giá trị LC50 là 1,82 ppm, tiếp theo là Eucalyptol với giá trị LC50 là 17,60 ppm sau 24 giờ tiếp xúc. Năm hợp chất còn lại được thử nghiệm có hại ở mức độ trung bình đối với người lớn với LC50 dao động từ 140,79 đến 737,01 ppm (Bảng 3). Malathion organophosphorus tổng hợp kém mạnh hơn eudesmol và cao hơn sáu hợp chất khác, với giá trị LC50 là 5,44 ppm trong thời gian tiếp xúc 24 giờ (Bảng 3, Bảng bổ sung 6).
Bảy hợp chất chì mạnh và tamephosate organophosphorus đã được chọn để tạo thành các kết hợp nhị phân của liều LC50 của chúng theo tỷ lệ 1:1. Tổng cộng có 28 kết hợp nhị phân đã được chuẩn bị và thử nghiệm về hiệu quả diệt ấu trùng của chúng đối với Aedes aegypti. Chín kết hợp được tìm thấy là hiệp đồng, 14 kết hợp là đối kháng và năm kết hợp không phải là diệt ấu trùng. Trong số các kết hợp hiệp đồng, sự kết hợp của diallyl disulfide và temofol là hiệu quả nhất, với tỷ lệ tử vong 100% được quan sát thấy sau 24 giờ (Bảng 4). Tương tự như vậy, hỗn hợp limonene với diallyl disulfide và eugenol với thymetphos cho thấy tiềm năng tốt với tỷ lệ tử vong ấu trùng được quan sát thấy là 98,3% (Bảng 5). 4 sự kết hợp còn lại, cụ thể là eudesmol cộng với eucalyptol, eudesmol cộng với limonene, eucalyptol cộng với alpha-pinene, alpha-pinene cộng với temephos, cũng cho thấy hiệu quả diệt ấu trùng đáng kể, với tỷ lệ tử vong quan sát được vượt quá 90%. Tỷ lệ tử vong dự kiến ​​​​là gần 60-75%. (Bảng 4). Tuy nhiên, sự kết hợp của limonene với α-pinene hoặc khuynh diệp cho thấy phản ứng đối kháng. Tương tự như vậy, hỗn hợp Temephos với eugenol hoặc khuynh diệp hoặc eudesmol hoặc diallyl trisulfide đã được phát hiện có tác dụng đối kháng. Tương tự như vậy, sự kết hợp của diallyl disulfide và diallyl trisulfide và sự kết hợp của bất kỳ hợp chất nào trong số này với eudesmol hoặc eugenol đều có tác dụng đối kháng trong tác dụng diệt ấu trùng của chúng. Sự đối kháng cũng đã được báo cáo với sự kết hợp của eudesmol với eugenol hoặc α-pinene.
Trong số tất cả 28 hỗn hợp nhị phân được thử nghiệm về hoạt động axit ở người lớn, 7 kết hợp có tác dụng hiệp đồng, 6 không có tác dụng và 15 có tác dụng đối kháng. Các hỗn hợp eudesmol với khuynh diệp và limonene với carvone được phát hiện có hiệu quả hơn các kết hợp hiệp đồng khác, với tỷ lệ tử vong sau 24 giờ lần lượt là 76% và 100% (Bảng 5). Malathion đã được quan sát thấy có tác dụng hiệp đồng với tất cả các kết hợp hợp chất ngoại trừ limonene và diallyl trisulfide. Mặt khác, sự đối kháng đã được tìm thấy giữa diallyl disulfide và diallyl trisulfide và sự kết hợp của bất kỳ chất nào trong số chúng với khuynh diệp, hoặc eucalyptol, hoặc carvone, hoặc limonene. Tương tự như vậy, sự kết hợp của α-pinene với eudesmol hoặc limonene, eucalyptol với carvone hoặc limonene, và limonene với eudesmol hoặc malathion cho thấy tác dụng diệt ấu trùng đối kháng. Đối với sáu sự kết hợp còn lại, không có sự khác biệt đáng kể giữa tỷ lệ tử vong dự kiến ​​và quan sát được (Bảng 5).
Dựa trên tác dụng hiệp đồng và liều dưới mức gây chết, độc tính diệt ấu trùng của chúng đối với một số lượng lớn muỗi Aedes aegypti cuối cùng đã được chọn và thử nghiệm thêm. Kết quả cho thấy tỷ lệ tử vong của ấu trùng quan sát được khi sử dụng các kết hợp nhị phân eugenol-limonene, diallyl disulfide-limonene và diallyl disulfide-timephos là 100%, trong khi tỷ lệ tử vong của ấu trùng dự kiến ​​lần lượt là 76,48%, 72,16% và 63,4% (Bảng 6). Sự kết hợp của limonene và eudesmol kém hiệu quả hơn tương đối, với tỷ lệ tử vong của ấu trùng là 88% được quan sát thấy trong thời gian tiếp xúc 24 giờ (Bảng 6). Tóm lại, bốn kết hợp nhị phân được chọn cũng chứng minh tác dụng hiệp đồng diệt ấu trùng đối với Aedes aegypti khi áp dụng trên diện rộng (Bảng 6).
Ba sự kết hợp hiệp đồng đã được chọn cho thử nghiệm sinh học diệt côn trùng trưởng thành để kiểm soát quần thể lớn muỗi Aedes aegypti trưởng thành. Để chọn các sự kết hợp để thử nghiệm trên các đàn côn trùng lớn, trước tiên chúng tôi tập trung vào hai sự kết hợp terpene hiệp đồng tốt nhất, cụ thể là carvone cộng với limonene và eucalyptol cộng với eudesmol. Thứ hai, sự kết hợp hiệp đồng tốt nhất được chọn từ sự kết hợp của malathion organophosphate tổng hợp và terpenoid. Chúng tôi tin rằng sự kết hợp của malathion và eudesmol là sự kết hợp tốt nhất để thử nghiệm trên các đàn côn trùng lớn do tỷ lệ tử vong quan sát được cao nhất và giá trị LC50 rất thấp của các thành phần ứng cử viên. Malathion thể hiện tác dụng hiệp đồng khi kết hợp với α-pinene, diallyl disulfide, eucalyptus, carvone và eudesmol. Nhưng nếu chúng ta xem xét các giá trị LC50, Eudesmol có giá trị thấp nhất (2,25 ppm). Các giá trị LC50 được tính toán của malathion, α-pinene, diallyl disulfide, eucalyptol và carvone lần lượt là 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 và 140,79 ppm. Các giá trị này chỉ ra rằng sự kết hợp của malathion và eudesmol là sự kết hợp tối ưu về mặt liều lượng. Kết quả cho thấy sự kết hợp của carvone cộng với limonene và eudesmol cộng với malathion có tỷ lệ tử vong được quan sát thấy là 100% so với tỷ lệ tử vong dự kiến ​​là 61% đến 65%. Một sự kết hợp khác, eudesmol cộng với eucalyptol, cho thấy tỷ lệ tử vong là 78,66% sau 24 giờ tiếp xúc, so với tỷ lệ tử vong dự kiến ​​là 60%. Cả ba sự kết hợp được chọn đều thể hiện tác dụng hiệp đồng ngay cả khi áp dụng trên diện rộng đối với muỗi Aedes aegypti trưởng thành (Bảng 6).
Trong nghiên cứu này, các tinh dầu thực vật được chọn như Mp, As, Os, Em và Cl cho thấy tác dụng diệt ấu trùng và trưởng thành đầy hứa hẹn của Aedes aegypti. Tinh dầu Mp có hoạt tính diệt ấu trùng cao nhất với giá trị LC50 là 0,42 ppm, tiếp theo là tinh dầu As, Os và Em với giá trị LC50 dưới 50 ppm sau 24 giờ. Những kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về muỗi và các loại ruồi hai cánh khác10,11,12,13,14. Mặc dù hiệu lực diệt ấu trùng của Cl thấp hơn các loại tinh dầu khác, với giá trị LC50 là 163,65 ppm sau 24 giờ, nhưng tiềm năng diệt ấu trùng của nó là cao nhất với giá trị LC50 là 23,37 ppm sau 24 giờ. Các EO Mp, As và Em cũng cho thấy tiềm năng diệt dị ứng tốt với giá trị LC50 trong khoảng 100–120 ppm sau 24 giờ tiếp xúc, nhưng tương đối thấp hơn hiệu quả diệt ấu trùng của chúng. Mặt khác, EO Os cho thấy tác dụng diệt dị ứng không đáng kể ngay cả ở liều điều trị cao nhất. Do đó, kết quả chỉ ra rằng độc tính của ethylene oxide đối với thực vật có thể thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của muỗi15. Nó cũng phụ thuộc vào tốc độ xâm nhập của EO vào cơ thể côn trùng, sự tương tác của chúng với các enzyme mục tiêu cụ thể và khả năng giải độc của muỗi ở mỗi giai đoạn phát triển16. Một số lượng lớn các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hợp chất thành phần chính là một yếu tố quan trọng trong hoạt động sinh học của ethylene oxide, vì nó chiếm phần lớn tổng số hợp chất3,12,17,18. Do đó, chúng tôi đã xem xét hai hợp chất chính trong mỗi EO. Dựa trên kết quả GC-MS, diallyl disulfide và diallyl trisulfide được xác định là các hợp chất chính của EO As, điều này phù hợp với các báo cáo trước đây19,20,21. Mặc dù các báo cáo trước đây chỉ ra rằng menthol là một trong những hợp chất chính của nó, carvone và limonene một lần nữa được xác định là các hợp chất chính của Mp EO22,23. Hồ sơ thành phần của Os EO cho thấy eugenol và methyl eugenol là các hợp chất chính, điều này tương tự như các phát hiện của các nhà nghiên cứu trước đó16,24. Eucalyptol và eucalyptol đã được báo cáo là các hợp chất chính có trong tinh dầu lá Em, điều này phù hợp với các phát hiện của một số nhà nghiên cứu25,26 nhưng trái ngược với các phát hiện của Olalade et al.27. Sự thống trị của cineole và α-pinene đã được quan sát thấy trong tinh dầu tràm trà, điều này tương tự như các nghiên cứu trước đây28,29. Sự khác biệt trong loài về thành phần và nồng độ của các loại tinh dầu được chiết xuất từ ​​cùng một loài thực vật ở các địa điểm khác nhau đã được báo cáo và cũng được quan sát thấy trong nghiên cứu này, chịu ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng thực vật theo địa lý, thời gian thu hoạch, giai đoạn phát triển hoặc tuổi thực vật, sự xuất hiện của kiểu gen, v.v.22,30,31,32. Các hợp chất chính được xác định sau đó đã được mua và thử nghiệm về tác dụng diệt ấu trùng và tác dụng đối với muỗi Aedes aegypti trưởng thành. Kết quả cho thấy hoạt động diệt ấu trùng của diallyl disulfide tương đương với hoạt động của EO As thô. Nhưng hoạt động của diallyl trisulfide cao hơn EO As. Những kết quả này tương tự như kết quả thu được của Kimbaris et al. 33 trên Culex philippines. Tuy nhiên, hai hợp chất này không cho thấy hoạt động tự diệt tốt đối với muỗi mục tiêu, phù hợp với kết quả của Plata-Rueda et al. 34 trên Tenebrio molitor. Os EO có hiệu quả đối với giai đoạn ấu trùng của Aedes aegypti, nhưng không hiệu quả đối với giai đoạn trưởng thành. Người ta đã xác định rằng hoạt động diệt ấu trùng của các hợp chất riêng lẻ chính thấp hơn hoạt động của Os EO thô. Điều này ngụ ý vai trò của các hợp chất khác và sự tương tác của chúng trong ethylene oxide thô. Methyl eugenol đơn lẻ có hoạt động không đáng kể, trong khi eugenol đơn lẻ có hoạt động diệt ấu trùng ở mức trung bình. Kết luận này một mặt khẳng định35,36, và mặt khác, mâu thuẫn với kết luận của các nhà nghiên cứu trước đó37,38. Sự khác biệt trong các nhóm chức năng của eugenol và methyleugenol có thể dẫn đến độc tính khác nhau đối với cùng một loài côn trùng mục tiêu39. Limonene được phát hiện có hoạt động diệt ấu trùng ở mức trung bình, trong khi tác dụng của carvone là không đáng kể. Tương tự như vậy, độc tính tương đối thấp của limonene đối với côn trùng trưởng thành và độc tính cao của carvone hỗ trợ cho kết quả của một số nghiên cứu trước đây40 nhưng mâu thuẫn với những nghiên cứu khác41. Sự hiện diện của các liên kết đôi ở cả vị trí vòng trong và vòng ngoài có thể làm tăng lợi ích của các hợp chất này như thuốc diệt ấu trùng3,41, trong khi carvone, là một ketone có carbon alpha và beta không bão hòa, có thể biểu hiện khả năng gây độc cao hơn ở người lớn42. Tuy nhiên, các đặc điểm riêng lẻ của limonene và carvone thấp hơn nhiều so với tổng EO Mp (Bảng 1, Bảng 3). Trong số các terpenoid đã thử nghiệm, eudesmol được phát hiện có hoạt tính diệt ấu trùng và muỗi trưởng thành lớn nhất với giá trị LC50 dưới 2,5 ppm, khiến nó trở thành một hợp chất đầy hứa hẹn để kiểm soát muỗi Aedes. Hiệu suất của nó tốt hơn hiệu suất của toàn bộ EO Em, mặc dù điều này không phù hợp với phát hiện của Cheng et al.40. Eudesmol là một sesquiterpene có hai đơn vị isopren ít bay hơi hơn các monoterpene có oxy như bạch đàn và do đó có tiềm năng lớn hơn như một loại thuốc trừ sâu. Bản thân Eucalyptol có hoạt tính diệt côn trùng ở người lớn mạnh hơn so với ở ấu trùng, và kết quả từ các nghiên cứu trước đó vừa ủng hộ vừa bác bỏ điều này37,43,44. Riêng hoạt tính này gần như tương đương với hoạt tính của toàn bộ EO Cl. Một monoterpene bicyclic khác, α-pinene, có ít tác dụng ở người lớn đối với Aedes aegypti hơn so với tác dụng diệt ấu trùng, ngược lại với tác dụng của toàn bộ EO Cl. Hoạt tính diệt côn trùng tổng thể của terpenoid bị ảnh hưởng bởi tính ưa béo, dễ bay hơi, phân nhánh carbon, diện tích chiếu, diện tích bề mặt, nhóm chức năng và vị trí của chúng45,46. Các hợp chất này có thể hoạt động bằng cách phá hủy sự tích tụ tế bào, ngăn chặn hoạt động hô hấp, làm gián đoạn quá trình truyền xung thần kinh, v.v. 47 Temephos organophosphate tổng hợp được phát hiện có hoạt tính diệt ấu trùng cao nhất với giá trị LC50 là 0,43 ppm, phù hợp với dữ liệu của Lek -Utala48. Hoạt động của malathion organophosphorus tổng hợp ở người trưởng thành được báo cáo ở mức 5,44 ppm. Mặc dù hai loại organophosphate này đã cho thấy phản ứng thuận lợi đối với các chủng Aedes aegypti trong phòng thí nghiệm, nhưng khả năng kháng thuốc của muỗi đối với các hợp chất này đã được báo cáo ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới49. Tuy nhiên, không có báo cáo tương tự nào về sự phát triển khả năng kháng thuốc thảo dược được tìm thấy50. Do đó, các loại thảo mộc được coi là các lựa chọn thay thế tiềm năng cho thuốc trừ sâu hóa học trong các chương trình kiểm soát véc tơ.
Tác dụng diệt ấu trùng đã được thử nghiệm trên 28 tổ hợp nhị phân (1:1) được chuẩn bị từ terpenoid mạnh và terpenoid với thymetphos, và 9 tổ hợp được phát hiện là có tác dụng hiệp đồng, 14 đối kháng và 5 đối kháng. Không có tác dụng. Mặt khác, trong thử nghiệm sinh học về hiệu lực của ấu trùng trưởng thành, 7 tổ hợp được phát hiện là có tác dụng hiệp đồng, 15 tổ hợp là đối kháng và 6 tổ hợp được báo cáo là không có tác dụng. Lý do tại sao một số tổ hợp tạo ra tác dụng hiệp đồng có thể là do các hợp chất ứng cử viên tương tác đồng thời theo các con đường quan trọng khác nhau hoặc do sự ức chế tuần tự của các enzyme chính khác nhau của một con đường sinh học cụ thể51. Sự kết hợp của limonene với diallyl disulfide, khuynh diệp hoặc eugenol được phát hiện là có tác dụng hiệp đồng trong cả ứng dụng quy mô nhỏ và lớn (Bảng 6), trong khi sự kết hợp của nó với khuynh diệp hoặc α-pinene được phát hiện là có tác dụng đối kháng đối với ấu trùng. Trung bình, limonene có vẻ là một chất hiệp đồng tốt, có thể là do sự hiện diện của các nhóm methyl, khả năng thâm nhập tốt vào lớp sừng và cơ chế hoạt động khác nhau52,53. Trước đây đã có báo cáo rằng limonene có thể gây ra tác dụng độc hại bằng cách thâm nhập vào lớp biểu bì của côn trùng (độc tính tiếp xúc), ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa (chất chống ăn) hoặc ảnh hưởng đến hệ hô hấp (hoạt động xông hơi),54 trong khi phenylpropanoid như eugenol có thể ảnh hưởng đến các enzym chuyển hóa 55. Do đó, sự kết hợp của các hợp chất có cơ chế hoạt động khác nhau có thể làm tăng tác dụng gây chết tổng thể của hỗn hợp. Eucalyptol được phát hiện có tác dụng hiệp đồng với diallyl disulfide, eucalyptus hoặc α-pinene, nhưng các sự kết hợp khác với các hợp chất khác không có tác dụng diệt ấu trùng hoặc đối kháng. Các nghiên cứu ban đầu cho thấy eucalyptol có hoạt tính ức chế acetylcholinesterase (AChE), cũng như các thụ thể octaamine và GABA56. Vì các monoterpen vòng, eucalyptol, eugenol, v.v. có thể có cùng cơ chế hoạt động như hoạt động gây độc thần kinh của chúng, 57 do đó giảm thiểu tác dụng kết hợp của chúng thông qua ức chế lẫn nhau. Tương tự như vậy, sự kết hợp của Temephos với diallyl disulfide, α-pinene và limonene được phát hiện là có tác dụng hiệp đồng, hỗ trợ các báo cáo trước đây về tác dụng hiệp đồng giữa các sản phẩm thảo dược và organophosphate tổng hợp58.
Sự kết hợp của eudesmol và eucalyptol được phát hiện có tác dụng hiệp đồng lên giai đoạn ấu trùng và trưởng thành của Aedes aegypti, có thể là do cơ chế hoạt động khác nhau của chúng do cấu trúc hóa học khác nhau. Eudesmol (một sesquiterpene) có thể ảnh hưởng đến hệ hô hấp 59 và eucalyptol (một monoterpene) có thể ảnh hưởng đến acetylcholinesterase 60. Việc tiếp xúc đồng thời các thành phần với hai hoặc nhiều vị trí mục tiêu có thể làm tăng tác dụng gây chết tổng thể của sự kết hợp này. Trong các xét nghiệm sinh học về chất ở người lớn, malathion được phát hiện có tác dụng hiệp đồng với carvone hoặc eucalyptol hoặc eucalyptol hoặc diallyl disulfide hoặc α-pinene, cho thấy rằng nó có tác dụng hiệp đồng khi bổ sung limonene và di. Các ứng cử viên thuốc diệt dị ứng có tác dụng hiệp đồng tốt cho toàn bộ danh mục hợp chất terpene, ngoại trừ allyl trisulfide. Thangam và Kathiresan61 cũng báo cáo kết quả tương tự về tác dụng hiệp đồng của malathion với chiết xuất thảo dược. Phản ứng hiệp đồng này có thể là do tác dụng độc hại kết hợp của malathion và các chất hóa học thực vật lên các enzym giải độc của côn trùng. Các organophosphate như malathion thường hoạt động bằng cách ức chế các esterase cytochrome P450 và monooxygenase62,63,64. Do đó, kết hợp malathion với các cơ chế hoạt động này và terpene với các cơ chế hoạt động khác nhau có thể tăng cường tác dụng gây chết tổng thể đối với muỗi.
Mặt khác, tính đối kháng chỉ ra rằng các hợp chất được chọn ít hoạt động hơn khi kết hợp so với từng hợp chất riêng lẻ. Lý do cho tính đối kháng trong một số kết hợp có thể là một hợp chất làm thay đổi hành vi của hợp chất kia bằng cách thay đổi tốc độ hấp thụ, phân phối, chuyển hóa hoặc bài tiết. Các nhà nghiên cứu ban đầu coi đây là nguyên nhân gây ra tính đối kháng trong các kết hợp thuốc. Phân tử Cơ chế có thể 65. Tương tự như vậy, các nguyên nhân có thể gây ra tính đối kháng có thể liên quan đến các cơ chế hoạt động tương tự, sự cạnh tranh của các hợp chất cấu thành cho cùng một thụ thể hoặc vị trí đích. Trong một số trường hợp, sự ức chế không cạnh tranh của protein đích cũng có thể xảy ra. Trong nghiên cứu này, hai hợp chất organosulfur, diallyl disulfide và diallyl trisulfide, cho thấy tác dụng đối kháng, có thể là do sự cạnh tranh cho cùng một vị trí đích. Tương tự như vậy, hai hợp chất lưu huỳnh này cho thấy tác dụng đối kháng và không có tác dụng khi kết hợp với eudesmol và α-pinene. Eudesmol và alpha-pinene có bản chất là vòng, trong khi diallyl disulfide và diallyl trisulfide có bản chất là aliphatic. Dựa trên cấu trúc hóa học, sự kết hợp của các hợp chất này sẽ làm tăng hoạt động gây chết tổng thể vì các vị trí đích của chúng thường khác nhau34,47, nhưng trong thực nghiệm, chúng tôi đã tìm thấy sự đối kháng, có thể là do vai trò của các hợp chất này trong một số hệ thống sinh vật chưa biết trong cơ thể sống do tương tác. Tương tự như vậy, sự kết hợp của cineole và α-pinene tạo ra phản ứng đối kháng, mặc dù các nhà nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng hai hợp chất này có các mục tiêu tác động khác nhau47,60. Vì cả hai hợp chất đều là monoterpen vòng, nên có thể có một số vị trí đích chung có thể cạnh tranh để liên kết và ảnh hưởng đến độc tính tổng thể của các cặp kết hợp được nghiên cứu.
Dựa trên các giá trị LC50 và tỷ lệ tử vong quan sát được, hai sự kết hợp terpene có tác dụng hiệp đồng tốt nhất đã được chọn, cụ thể là cặp carvone + limonene và eucalyptol + eudesmol, cũng như malathion organophosphorus tổng hợp với terpene. Sự kết hợp hiệp đồng tối ưu của các hợp chất malathion + Eudesmol đã được thử nghiệm trong một xét nghiệm sinh học thuốc trừ sâu dành cho người lớn. Nhắm mục tiêu vào các đàn côn trùng lớn để xác nhận liệu những sự kết hợp hiệu quả này có thể có tác dụng chống lại số lượng lớn cá thể trong không gian tiếp xúc tương đối lớn hay không. Tất cả các sự kết hợp này đều chứng minh tác dụng hiệp đồng chống lại các đàn côn trùng lớn. Các kết quả tương tự đã thu được đối với sự kết hợp diệt ấu trùng hiệp đồng tối ưu được thử nghiệm trên các quần thể ấu trùng Aedes aegypti lớn. Do đó, có thể nói rằng sự kết hợp hiệp đồng diệt ấu trùng và diệt trưởng thành hiệu quả của các hợp chất EO thực vật là một ứng cử viên mạnh chống lại các hóa chất tổng hợp hiện có và có thể được sử dụng thêm để kiểm soát các quần thể Aedes aegypti. Tương tự như vậy, sự kết hợp hiệu quả của thuốc diệt ấu trùng tổng hợp hoặc thuốc diệt trưởng thành với terpene cũng có thể được sử dụng để giảm liều lượng thymetphos hoặc malathion dùng cho muỗi. Những sự kết hợp hiệp đồng mạnh mẽ này có thể cung cấp giải pháp cho các nghiên cứu trong tương lai về sự tiến hóa của khả năng kháng thuốc ở muỗi Aedes.
Trứng của Aedes aegypti được thu thập từ Trung tâm nghiên cứu y khoa khu vực, Dibrugarh, Hội đồng nghiên cứu y khoa Ấn Độ và được nuôi ở nhiệt độ được kiểm soát (28 ± 1 °C) và độ ẩm (85 ± 5%) tại Khoa Động vật học, Đại học Gauhati trong các điều kiện sau: Arivoli đã được mô tả et al. Sau khi nở, ấu trùng được cho ăn thức ăn của ấu trùng (bột bánh quy cho chó và men theo tỷ lệ 3:1) và muỗi trưởng thành được cho ăn dung dịch glucose 10%. Bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi xuất hiện, muỗi cái trưởng thành được phép hút máu của chuột bạch. Ngâm giấy lọc trong nước trong cốc và đặt vào lồng đẻ trứng.
Các mẫu thực vật được chọn gồm lá bạch đàn (Myrtaceae), húng quế (Lamiaceae), bạc hà (Lamiaceae), tràm trà (Myrtaceae) và củ hành (Amaryllidaceae). Thu thập từ Guwahati và được xác định bởi Khoa Thực vật học, Đại học Gauhati. Các mẫu thực vật được thu thập (500 g) được chưng cất bằng máy Clevenger trong 6 giờ. EO chiết xuất được thu thập trong các lọ thủy tinh sạch và bảo quản ở 4°C để nghiên cứu thêm.
Độc tính diệt ấu trùng được nghiên cứu bằng các quy trình chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới đã được sửa đổi một chút 67 . Sử dụng DMSO làm chất nhũ hóa. Mỗi nồng độ EO ban đầu được thử nghiệm ở mức 100 và 1000 ppm, phơi nhiễm 20 ấu trùng trong mỗi lần lặp lại. Dựa trên kết quả, một phạm vi nồng độ đã được áp dụng và tỷ lệ tử vong đã được ghi lại từ 1 giờ đến 6 giờ (cách nhau 1 giờ) và sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi xử lý. Nồng độ dưới mức gây chết (LC50) đã được xác định sau 24, 48 và 72 giờ phơi nhiễm. Mỗi nồng độ đã được thử nghiệm theo bộ ba cùng với một đối chứng âm tính (chỉ có nước) và một đối chứng dương tính (nước được xử lý bằng DMSO). Nếu xảy ra hiện tượng nhộng hóa và hơn 10% ấu trùng của nhóm đối chứng chết, thì thí nghiệm sẽ được lặp lại. Nếu tỷ lệ tử vong ở nhóm đối chứng nằm trong khoảng 5-10%, hãy sử dụng công thức hiệu chỉnh Abbott 68.
Phương pháp do Ramar và cộng sự mô tả đã được sử dụng cho xét nghiệm sinh học muỗi trưởng thành chống lại Aedes aegypti bằng cách sử dụng acetone làm dung môi. Mỗi EO ban đầu được thử nghiệm trên muỗi Aedes aegypti trưởng thành ở nồng độ 100 và 1000 ppm. Nhỏ 2 ml của mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào số Whatman. 1 tờ giấy lọc (kích thước 12 x 15 cm2) và để acetone bay hơi trong 10 phút. Giấy lọc chỉ được xử lý bằng 2 ml acetone được sử dụng làm đối chứng. Sau khi acetone bay hơi, giấy lọc đã xử lý và giấy lọc đối chứng được đặt trong một ống hình trụ (sâu 10 cm). Mười con muỗi không hút máu từ 3 đến 4 ngày tuổi được chuyển đến bộ ba của mỗi nồng độ. Dựa trên kết quả của các thử nghiệm sơ bộ, các nồng độ khác nhau của các loại dầu đã chọn đã được thử nghiệm. Tỷ lệ tử vong được ghi nhận tại thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi thả muỗi. Tính giá trị LC50 cho thời gian tiếp xúc là 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Nếu tỷ lệ tử vong của lô đối chứng vượt quá 20%, hãy lặp lại toàn bộ thử nghiệm. Tương tự, nếu tỷ lệ tử vong ở nhóm đối chứng lớn hơn 5%, hãy điều chỉnh kết quả cho các mẫu được xử lý bằng công thức của Abbott68.
Sắc ký khí (Agilent 7890A) và khối phổ (Accu TOF GCv, Jeol) được thực hiện để phân tích các hợp chất cấu thành của các loại tinh dầu đã chọn. GC được trang bị đầu dò FID và cột mao quản (HP5-MS). Khí mang là heli, tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút. Chương trình GC đặt Allium sativum thành 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M và Ocimum Sainttum thành 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, đối với bạc hà là 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, đối với bạch đàn là 20,60-1M-10-200-3M-30-280 và đối với đỏ. Đối với một nghìn lớp, chúng là 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Các hợp chất chính của mỗi EO được xác định dựa trên phần trăm diện tích được tính toán từ sắc ký đồ GC và kết quả khối phổ (tham khảo cơ sở dữ liệu tiêu chuẩn NIST 70).
Hai hợp chất chính trong mỗi EO được chọn dựa trên kết quả GC-MS và được mua từ Sigma-Aldrich với độ tinh khiết 98–99% để tiến hành các xét nghiệm sinh học tiếp theo. Các hợp chất được thử nghiệm về hiệu quả diệt ấu trùng và trưởng thành đối với Aedes aegypti như mô tả ở trên. Thuốc diệt ấu trùng tổng hợp được sử dụng phổ biến nhất là tamephosate (Sigma Aldrich) và thuốc malathion dành cho người lớn (Sigma Aldrich) đã được phân tích để so sánh hiệu quả của chúng với các hợp chất EO đã chọn, theo cùng một quy trình.
Hỗn hợp nhị phân của các hợp chất terpene đã chọn và các hợp chất terpene cộng với các hợp chất organophosphate thương mại (tilephos và malathion) đã được chuẩn bị bằng cách trộn liều LC50 của từng hợp chất ứng viên theo tỷ lệ 1:1. Các kết hợp đã chuẩn bị đã được thử nghiệm trên giai đoạn ấu trùng và trưởng thành của Aedes aegypti như mô tả ở trên. Mỗi xét nghiệm sinh học được thực hiện ba lần cho mỗi kết hợp và ba lần cho các hợp chất riêng lẻ có trong mỗi kết hợp. Cái chết của côn trùng mục tiêu được ghi lại sau 24 giờ. Tính tỷ lệ tử vong dự kiến ​​cho một hỗn hợp nhị phân bằng cách sử dụng công thức sau.
trong đó E = tỷ lệ tử vong dự kiến ​​của muỗi Aedes aegypti khi phản ứng với tổ hợp nhị phân, tức là kết nối (A + B).
Hiệu ứng của mỗi hỗn hợp nhị phân được dán nhãn là hiệp đồng, đối kháng hoặc không có hiệu ứng dựa trên giá trị χ2 được tính toán theo phương pháp được mô tả bởi Pavla52. Tính giá trị χ2 cho mỗi kết hợp bằng công thức sau.
Hiệu ứng của một sự kết hợp được định nghĩa là hiệp đồng khi giá trị χ2 tính toán lớn hơn giá trị bảng cho các bậc tự do tương ứng (khoảng tin cậy 95%) và nếu tỷ lệ tử vong quan sát được phát hiện vượt quá tỷ lệ tử vong dự kiến. Tương tự, nếu giá trị χ2 tính toán cho bất kỳ sự kết hợp nào vượt quá giá trị bảng với một số bậc tự do, nhưng tỷ lệ tử vong quan sát được thấp hơn tỷ lệ tử vong dự kiến, thì phương pháp điều trị được coi là đối kháng. Và nếu trong bất kỳ sự kết hợp nào, giá trị χ2 tính toán được nhỏ hơn giá trị bảng trong các bậc tự do tương ứng, thì sự kết hợp được coi là không có hiệu ứng.
Ba đến bốn tổ hợp có khả năng hiệp đồng (100 ấu trùng và 50 hoạt động diệt ấu trùng và côn trùng trưởng thành) đã được chọn để thử nghiệm trên một số lượng lớn côn trùng. Trưởng thành) tiến hành như trên. Cùng với các hỗn hợp, các hợp chất riêng lẻ có trong các hỗn hợp đã chọn cũng được thử nghiệm trên số lượng ấu trùng và trưởng thành Aedes aegypti bằng nhau. Tỷ lệ kết hợp là một phần liều LC50 của một hợp chất ứng cử viên và một phần liều LC50 của hợp chất thành phần khác. Trong xét nghiệm sinh học về hoạt động của côn trùng trưởng thành, các hợp chất đã chọn được hòa tan trong dung môi acetone và áp dụng cho giấy lọc được bọc trong một hộp nhựa hình trụ 1300 cm3. Acetone được làm bay hơi trong 10 phút và các con trưởng thành được giải phóng. Tương tự như vậy, trong xét nghiệm sinh học diệt ấu trùng, các liều hợp chất ứng cử viên LC50 đầu tiên được hòa tan trong các thể tích bằng nhau của DMSO và sau đó trộn với 1 lít nước được bảo quản trong các hộp nhựa 1300 cc và các ấu trùng được giải phóng.
Phân tích xác suất của 71 dữ liệu tử vong được ghi lại đã được thực hiện bằng phần mềm SPSS (phiên bản 16) và Minitab để tính toán giá trị LC50.