Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản mới hơn của trình duyệt (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng hoặc JavaScript.
Việc khám phá và sử dụng có lợi các sản phẩm tự nhiên có thể giúp cải thiện cuộc sống của con người. Các hóa chất ức chế sinh trưởng thực vật được sử dụng rộng rãi như thuốc diệt cỏ để kiểm soát cỏ dại. Do nhu cầu sử dụng các loại thuốc diệt cỏ khác nhau, nên cần phải xác định các hợp chất có cơ chế hoạt động mới. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất N-alkoxypyrrole mới, coumamonamide, từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và thiết lập quy trình tổng hợp hoàn chỉnh. Thông qua các xét nghiệm hoạt tính sinh học, chúng tôi phát hiện ra rằng axit urs-monoamic là chất trung gian tổng hợp của urs-monoamide và là mộtchất ức chế tăng trưởng thực vật. Ngoài ra, chúng tôi đã phát triển nhiều dẫn xuất axit urbenonic khác nhau, bao gồm dẫn xuất urbenyloxy (UDA), có hoạt tính diệt cỏ cao mà không ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của tế bào HeLa. Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng các dẫn xuất axit urmotonic phá vỡ các vi ống thực vật; ngoài ra, KAND ảnh hưởng đến các sợi actin và gây chết tế bào; Những tác động đa diện này khác với các tác động của các chất ức chế vi ống đã biết và gợi ý một cơ chế hoạt động mới của axit ursonic, đây là một lợi thế quan trọng trong quá trình phát triển các loại thuốc diệt cỏ mới.
Việc khám phá và ứng dụng thực tế các sản phẩm tự nhiên có lợi và các dẫn xuất của chúng là một phương tiện để cải thiện chất lượng cuộc sống của con người. Các chất chuyển hóa thứ cấp do vi sinh vật, thực vật và côn trùng tạo ra đã dẫn đến những tiến bộ lớn trong y học và nông nghiệp. Nhiều loại thuốc kháng sinh và thuốc chống bệnh bạch cầu đã được phát triển từ các sản phẩm tự nhiên. Ngoài ra, nhiều loạithuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm và thuốc diệt cỏ được chiết xuất từ các sản phẩm tự nhiên này để sử dụng trong nông nghiệp. Đặc biệt, thuốc diệt cỏ dại là công cụ quan trọng để tăng năng suất cây trồng trong nông nghiệp hiện đại và nhiều loại hợp chất khác nhau đã được sử dụng trong thương mại. Một số quá trình tế bào ở thực vật, chẳng hạn như quang hợp, chuyển hóa axit amin, tổng hợp thành tế bào, điều hòa nguyên phân, truyền tín hiệu phytohormone hoặc tổng hợp protein, được coi là mục tiêu điển hình của thuốc diệt cỏ. Các hợp chất ức chế chức năng vi ống là một nhóm thuốc diệt cỏ phổ biến ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật bằng cách ảnh hưởng đến quá trình điều hòa nguyên phân2.
Vi ống là thành phần của bộ khung tế bào và được bảo tồn rộng rãi trong các tế bào nhân chuẩn. Dị hợp tử tubulin bao gồm α-tubulin và β-tubulin tạo thành các nguyên sợi vi ống tuyến tính, với 13 nguyên sợi tạo thành cấu trúc hình trụ. Vi ống đóng nhiều vai trò trong tế bào thực vật, bao gồm xác định hình dạng tế bào, phân chia tế bào và vận chuyển nội bào3,4. Tế bào thực vật chứa các vi ống bên dưới màng tế bào chất pha trung gian và những vi ống vỏ này được cho là kiểm soát sự tổ chức của các vi sợi cellulose thông qua việc điều hòa các phức hợp synthase cellulose4,5. Vi ống vỏ của các tế bào biểu bì rễ, có trong vùng kéo dài nhanh của chóp rễ, nằm ở bên và các sợi vi cellulose đi theo các vi ống này và hạn chế hướng mở rộng tế bào, do đó thúc đẩy sự kéo dài tế bào dị hướng. Do đó, chức năng của vi ống có liên quan chặt chẽ đến hình thái thực vật. Sự thay thế axit amin trong gen mã hóa tubulin gây ra sự lệch của các mảng vi ống vỏ và sự phát triển về bên trái hoặc bên phải ở Arabidopsis 6,7. Tương tự như vậy, các đột biến trong các protein liên kết với vi ống điều chỉnh động lực học của vi ống cũng có thể dẫn đến sự phát triển của rễ bị biến dạng8,9,10,11,12,13. Ngoài ra, việc xử lý bằng thuốc diệt cỏ phá vỡ vi ống như disopyramide, còn được gọi là pretilachlor, cũng gây ra sự phát triển của rễ xiên bên trái14. Những dữ liệu này chỉ ra rằng việc điều chỉnh chính xác chức năng của vi ống là rất quan trọng để xác định hướng phát triển của cây.
Nhiều loại chất ức chế vi ống khác nhau đã được phát hiện và những loại thuốc này đã có những đóng góp đáng kể cho nghiên cứu về bộ xương tế bào, cũng như cho nông nghiệp và y học2. Đặc biệt, hợp chất oryzalin, dinitroaniline, disopyramide, hợp chất liên quan đến benzamide và các chất tương tự của chúng có thể ức chế chức năng của vi ống và do đó ức chế sự phát triển của thực vật. Do đó, chúng được sử dụng rộng rãi như thuốc diệt cỏ. Tuy nhiên, vì vi ống là thành phần quan trọng của tế bào thực vật và động vật, nên hầu hết các chất ức chế vi ống đều gây độc tế bào đối với cả hai loại tế bào. Do đó, mặc dù được công nhận là có tác dụng diệt cỏ, nhưng một số lượng hạn chế các tác nhân chống vi ống được sử dụng cho mục đích thực tế.
Streptomyces là một chi của họ Streptomyces, bao gồm vi khuẩn dạng sợi, gram dương, hiếu khí và được biết đến rộng rãi vì khả năng sản xuất nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp. Do đó, nó được coi là một trong những nguồn quan trọng nhất của các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mới. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới có tên là coumamonamide, được phân lập từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và S. werraensis ISP 5486. Sử dụng phân tích quang phổ và phân tích quang phổ đầy đủ, cấu trúc của coumamonamide đã được mô tả và bộ khung N-alkoxypyrrole độc đáo của nó đã được xác định. tổng hợp. Axit ursmonic, một chất trung gian tổng hợp của ursmonoamide và các dẫn xuất của nó, được phát hiện có tác dụng ức chế sự phát triển và nảy mầm của cây mô hình phổ biến Arabidopsis thaliana. Trong một nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt động, chúng tôi phát hiện ra rằng một hợp chất có C9 biến đổi thành axit ursonic, được gọi là dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (KAND), làm tăng đáng kể tác dụng ức chế sự phát triển và nảy mầm. Đáng chú ý là chất ức chế sinh trưởng thực vật mới được phát hiện cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của thuốc lá và rêu tản và không gây độc tế bào đối với vi khuẩn hoặc tế bào HeLa. Hơn nữa, một số dẫn xuất axit urmotonic gây ra kiểu hình rễ bị biến dạng, ngụ ý rằng các dẫn xuất này ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến các vi ống. Phù hợp với ý tưởng này, quan sát của chúng tôi về các vi ống được dán nhãn bằng phương pháp miễn dịch mô học hoặc bằng protein huỳnh quang cho thấy rằng xử lý KAND làm mất trùng hợp các vi ống. Ngoài ra, xử lý bằng các dẫn xuất axit kumamotonic đã phá vỡ các vi sợi actin. Do đó, chúng tôi đã phát hiện ra một chất ức chế sinh trưởng thực vật mới có cơ chế hoạt động độc đáo liên quan đến việc phá hủy bộ khung tế bào.
Chủng MK493-CF1 được phân lập từ đất ở Shinagawa-ku, Tokyo. Chủng MK493-CF1 hình thành nên sợi nấm mô đệm phân nhánh tốt. Trình tự một phần của gen RNA ribosome 16S (1422 bp) đã được xác định. Chủng này rất giống với S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: chủng điển hình, 99,93%). Dựa trên kết quả này, người ta xác định rằng chủng này có quan hệ họ hàng gần với chủng loại S. werraensis. Do đó, chúng tôi tạm thời đặt tên cho chủng này là S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T cũng tạo ra các hợp chất hoạt tính sinh học tương tự. Vì có rất ít nghiên cứu ban đầu về việc thu được các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật này, nên các nghiên cứu hóa học sâu hơn đã được tiến hành. Sau khi nuôi cấy S. werraensis MK493-CF1 trên môi trường lúa mạch bằng cách lên men thể rắn ở 30°C trong 14 ngày, môi trường được chiết xuất bằng 50% EtOH. 60 ml mẫu được sấy khô để thu được 59,5 mg chiết xuất thô. Chiết xuất thô được đưa vào HPLC pha đảo ngược để thu được N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, có tên là coumamonamide, 36,0 mg). Tổng lượng 1 chiếm khoảng 60% chiết xuất thô. Do đó, chúng tôi quyết định nghiên cứu chi tiết các tính chất của kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 là bột vô định hình màu trắng và khối phổ phân giải cao (HRESIMS) xác nhận C6H8N2O2 (Hình 1). Mảnh pyrrole thay thế C2 của hợp chất này được đặc trưng bởi δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH trong phổ NMR 1H: 4,5 Hz, H-5) và δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), và phổ NMR 13C cho thấy sự hiện diện của bốn nguyên tử cacbon sp2. Sự hiện diện của một nhóm amide ở vị trí C2 được đánh giá bằng tương quan HMBC từ proton C-3 đến carbon carbonyl amide ở δC 161,1. Ngoài ra, các đỉnh NMR 1 H và 13 C tại δH 4.10 (3H, S) và δC 68.3 chỉ ra sự hiện diện của nhóm N-methoxy trong phân tử. Mặc dù vị trí chính xác của nhóm methoxy vẫn chưa được xác định bằng cách sử dụng phân tích quang phổ như phổ chênh lệch tăng cường và viết tắt Overhauser hạt nhân (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide đã trở thành hợp chất ứng cử viên đầu tiên.
Để xác định cấu trúc chính xác của 1, tổng hợp toàn phần đã được thực hiện (Hình 2a). Xử lý 2-aminopyridine 2 có bán trên thị trường bằng m-CPBA tạo ra N-oxide 3 tương ứng về năng suất định lượng. Sau khi 2-aminoazid hóa 2, phản ứng ngưng tụ cyclocondensation do Abramovich mô tả đã được thực hiện trong benzen ở 90°C để thu được 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 mong muốn tính bằng gam. Tốc độ 60% (hai giai đoạn). 15,16. Metyl hóa và thủy phân 4 sau đó tạo ra axit 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (gọi là "axit cumotonic", 6) với năng suất tốt (70%, hai bước). Cuối cùng, amid hóa thông qua chất trung gian axit clorua 6 sử dụng amoniac trong nước tạo ra Kumamoto amide 1 với năng suất 98%. Tất cả dữ liệu phổ của tổng hợp 1 đều tương tự như 1 cô lập, do đó cấu trúc của 1 đã được xác định;
Tổng hợp và phân tích chung về hoạt tính sinh học của urbenamide và axit urbenic. (a) Tổng hợp toàn bộ amide Kumamoto. (b) Cây giống Arabidopsis Columbia (Col) hoang dã bảy ngày tuổi được trồng trên đĩa Murashige và Skoog (MS) chứa coumamonamide 6 hoặc coumamonamide 1 ở nồng độ đã chỉ định. Thanh tỷ lệ = 1 cm.
Đầu tiên, chúng tôi đánh giá các hoạt động sinh học của urbenamide và các chất trung gian của nó về khả năng điều chỉnh sự phát triển của thực vật. Chúng tôi đã thêm nhiều nồng độ khác nhau của ursmonamide 1 hoặc axit ursmonic 6 vào môi trường thạch MS và nuôi cấy cây con Arabidopsis thaliana trên môi trường này. Các xét nghiệm này cho thấy nồng độ cao (500 μM) của 6 đã ức chế sự phát triển của rễ (Hình 2b). Tiếp theo, chúng tôi đã tạo ra nhiều dẫn xuất khác nhau bằng cách thay thế vị trí N1 của 6 và thực hiện các nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc–hoạt động trên chúng (quy trình tổng hợp tương tự được mô tả trong Thông tin hỗ trợ (SI)). Cây con Arabidopsis được trồng trên môi trường chứa 50 μM dẫn xuất axit ursonic và chiều dài rễ được đo. như thể hiện trên hình ảnh. Như thể hiện trong Hình 3a, b và S1, axit coumamo có độ dài khác nhau của chuỗi alkoxy tuyến tính (9, 10, 11, 12 và 13) hoặc chuỗi alkoxy lớn (15, 16 và 17) ở vị trí N1. Các dẫn xuất cho thấy sự ức chế đáng kể đối với sự phát triển của rễ. Ngoài ra, chúng tôi thấy rằng việc áp dụng 200 μM 10, 11 hoặc 17 đã ức chế sự nảy mầm (Hình 3c và S2).
Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt động của amide Kumamoto và các hợp chất liên quan. (a) Cấu trúc và sơ đồ tổng hợp các chất tương tự. (b) Định lượng chiều dài rễ của cây con 7 ngày tuổi được trồng trên môi trường MS có hoặc không có dẫn xuất coumamonamide 50 μM. Dấu hoa thị chỉ ra sự khác biệt đáng kể với phương pháp xử lý giả (kiểm định t, p< 0,05).18. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD. nt có nghĩa là “không được thử nghiệm” vì hơn 50% hạt giống không nảy mầm. (c) Định lượng tỷ lệ nảy mầm của hạt giống đã xử lý được ủ trong môi trường MS trong 7 ngày có hoặc không có 200 μM coumamonamide và các hợp chất liên quan. Dấu hoa thị chỉ ra sự khác biệt đáng kể với phương pháp xử lý giả (kiểm định chi bình phương). n=96.
Điều thú vị là việc bổ sung các chuỗi bên alkyl dài hơn C9 đã làm giảm hoạt động ức chế, cho thấy các hợp chất liên quan đến axit kumamotoic cần các chuỗi bên có kích thước nhất định để thể hiện hoạt động sinh học của chúng.
Vì phân tích mối quan hệ cấu trúc-hoạt động cho thấy C9 đã được biến đổi thành axit ursonic và dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (sau đây gọi là KAND 11) là chất ức chế sinh trưởng thực vật hiệu quả nhất, chúng tôi đã tiến hành mô tả chi tiết hơn về KAND 11. Xử lý Arabidopsis bằng 50 μM KAND 11 gần như ngăn ngừa hoàn toàn sự nảy mầm, trong khi nồng độ thấp hơn (40, 30, 20 hoặc 10 μM) của KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 4a, b). Để kiểm tra xem KAND 11 có ảnh hưởng đến khả năng sống của mô phân sinh rễ hay không, chúng tôi đã kiểm tra mô phân sinh rễ được nhuộm bằng propidium iodide (PI) và đo kích thước diện tích mô phân sinh. Kích thước của mô phân sinh của cây con được trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND-11 là 151,1 ± 32,5 μm, trong khi kích thước của mô phân sinh của cây con được trồng trên môi trường đối chứng chứa DMSO là 264,7 ± 30,8 μm (Hình 4c, d), cho thấy KAND-11 phục hồi hoạt động của tế bào. lan rộng. Mô phân sinh rễ. Phù hợp với điều này, xử lý KAND 11 làm giảm lượng tín hiệu CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS của dấu hiệu phân chia tế bào trong mô phân sinh rễ (Hình 4e) 17 . Những kết quả này chỉ ra rằng KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ bằng cách giảm hoạt động tăng sinh tế bào.
Phân tích tác dụng ức chế của các dẫn xuất axit urbenonic (các dẫn xuất urbenyloxy) đối với sự phát triển. (a) Cây giống Col hoang dã 7 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS với nồng độ KAND 11 đã chỉ định. Thanh tỷ lệ = 1 cm. (b) Định lượng chiều dài rễ. Các chữ cái chỉ ra sự khác biệt đáng kể (thử nghiệm Tukey HSD, p< 0,05).16. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD. (c) Kính hiển vi cộng hưởng của rễ Col loại hoang dã nhuộm propidium iodide được trồng trên đĩa MS có hoặc không có 25 μM KAND 11. Dấu ngoặc trắng chỉ mô phân sinh rễ. Thanh tỷ lệ = 100 µm. (d) Định lượng kích thước mô phân sinh rễ (n = 10 đến 11). Sự khác biệt về mặt thống kê được xác định bằng cách sử dụng kiểm định t (p< 0,05). Các thanh biểu thị kích thước mô phân sinh trung bình. (e) Kính hiển vi tương phản giao thoa khác biệt (DIC) của mô phân sinh rễ chứa cấu trúc CDKB2; 1pro: CDKB2; nhuộm 1-GUS và nhuộm trên cây con 5 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS có hoặc không có xét nghiệm KAND 25 µM.
Độc tính thực vật của KAND 11 đã được thử nghiệm thêm bằng cách sử dụng một loại cây hai lá mầm khác, thuốc lá (Nicotiana tabacum), và một sinh vật mô hình thực vật trên cạn chính, rêu tản (Marchantia polymorpha). Giống như trường hợp của Arabidopsis, cây giống thuốc lá SR-1 được trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND 11 đã tạo ra rễ ngắn hơn (Hình 5a). Ngoài ra, 40 trong số 48 hạt nảy mầm trên các đĩa chứa 200 μM KAND 11, trong khi tất cả 48 hạt đều nảy mầm trên môi trường được xử lý giả, cho thấy nồng độ KAND cao hơn là đáng kể (p< 0,05; kiểm định chi bình phương) ức chế sự nảy mầm của thuốc lá. (Hình 5b). Ngoài ra, nồng độ KAND 11 ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong tản tương tự như nồng độ hiệu quả trong Arabidopsis (Hình 5c). Những kết quả này chỉ ra rằng KAND 11 có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại thực vật. Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các hợp chất liên quan đến monoamide gấu ở các sinh vật khác, cụ thể là tế bào HeLa của người và chủng Escherichia coli DH5α, lần lượt là đại diện của tế bào động vật bậc cao và tế bào vi khuẩn. Trong một loạt các xét nghiệm tăng sinh tế bào, chúng tôi quan sát thấy coumamonamide 1, axit coumamonamidic 6 và KAND 11 không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào HeLa hoặc E. coli ở nồng độ 100 μM (Hình 5d,e).
Ức chế tăng trưởng của KAND 11 ở các sinh vật không phải Arabidopsis. (a) Cây giống thuốc lá SR-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên các đĩa MS được định vị theo chiều dọc chứa 25 μM KAND 11. (b) Cây giống thuốc lá SR-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên các đĩa MS được định vị theo chiều ngang chứa 200 μM KAND 11. (c) Nụ tản Tak-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên các đĩa Gamborg B5 với nồng độ KAND 11 đã chỉ định. Mũi tên màu đỏ chỉ ra các bào tử ngừng phát triển trong thời gian ủ hai tuần. (d) Xét nghiệm tăng sinh tế bào của tế bào HeLa. Số lượng tế bào sống được đo theo các khoảng thời gian cố định bằng bộ đếm tế bào 8 (Dojindo). Để kiểm soát, các tế bào HeLa được xử lý bằng 5 μg/ml actinomycin D (Act D), chất ức chế phiên mã RNA polymerase và gây chết tế bào. Các phân tích được thực hiện theo bộ ba. (e) Xét nghiệm tăng sinh tế bào E. coli. Sự phát triển của E. coli được phân tích bằng cách đo OD600. Để kiểm soát, các tế bào được xử lý bằng 50 μg/ml ampicillin (Amp), chất ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Các phân tích được thực hiện theo ba lần.
Để giải mã cơ chế hoạt động của độc tính tế bào gây ra bởi các hợp chất liên quan đến uramide, chúng tôi đã phân tích lại các dẫn xuất axit urbenic có tác dụng ức chế vừa phải. như thể hiện trên hình ảnh. Như thể hiện trong Hình 2b, 6a, cây con được trồng trên đĩa thạch chứa nồng độ cao (200 μM) axit urmotonic 6 tạo ra rễ ngắn hơn và cong về bên trái (θ = - 23,7 ± 6,1), trong khi đối với cây con được trồng trên môi trường đối chứng, cây con tạo ra rễ gần như thẳng (θ = - 3,8 ± 7,1). Sự phát triển xiên đặc trưng này được biết là kết quả của rối loạn chức năng của vi ống vỏ14,18. Phù hợp với phát hiện này, các thuốc làm mất ổn định vi ống disopyramide và oryzalin đã gây ra sự nghiêng rễ tương tự trong điều kiện phát triển của chúng tôi (Hình 2b, 6a). Đồng thời, chúng tôi đã thử nghiệm các dẫn xuất axit urmotonic và chọn ra một số trong số chúng, ở một số nồng độ nhất định, gây ra sự phát triển rễ xiên. Hợp chất 8, 9 và 15 đã thay đổi hướng phát triển của rễ ở lần lượt là 75 μM, 50 μM và 40 μM, cho thấy rằng các hợp chất này có thể làm mất ổn định các vi ống một cách hiệu quả (Hình 2b, 6a). Chúng tôi cũng đã thử nghiệm dẫn xuất axit ursolic mạnh nhất, KAND 11, ở nồng độ thấp hơn (15 µM) và phát hiện ra rằng việc sử dụng KAND 11 đã ức chế sự phát triển của rễ và hướng phát triển của rễ không đồng đều, mặc dù chúng có xu hướng nghiêng về bên trái (Hình C3). . Vì nồng độ cao hơn của các loại thuốc làm mất ổn định vi ống đôi khi ức chế sự phát triển của cây thay vì gây ra sự nghiêng của rễ, sau đó chúng tôi đã đánh giá khả năng KAND 11 ảnh hưởng đến các vi ống bằng cách quan sát các vi ống vỏ trong các tế bào biểu bì rễ. Miễn dịch mô hóa học sử dụng kháng thể anti-β-tubulin trong các tế bào biểu bì của rễ cây con được xử lý bằng 25 μM KAND 11 cho thấy sự biến mất của hầu hết các vi ống vỏ trong các tế bào biểu bì ở vùng kéo dài (Hình 6b). Những kết quả này chỉ ra rằng axit kumamotonic và các dẫn xuất của nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên các vi ống để phá vỡ chúng và các hợp chất này là chất ức chế vi ống mới.
Axit ursonic và các dẫn xuất của nó làm thay đổi các vi ống vỏ ở Arabidopsis thaliana. (a) Góc nghiêng của rễ được đo khi có sự hiện diện của các dẫn xuất axit urmotonic khác nhau ở nồng độ đã chỉ định. Tác động của hai hợp chất được biết là ức chế các vi ống: disopyramide và oryzalin cũng đã được phân tích. Phần chèn cho thấy tiêu chuẩn được sử dụng để đo góc tăng trưởng của rễ. Dấu hoa thị chỉ ra sự khác biệt đáng kể với phương pháp xử lý giả (kiểm định t, p< 0,05).19. Thanh tỷ lệ = 1 cm. (b) Các vi ống vỏ trong các tế bào biểu bì ở vùng kéo dài. Các vi ống trong rễ cây Arabidopsis Col loại hoang dã được nuôi cấy trên đĩa MS có hoặc không có 25 μM KAND 11 được hình dung bằng phương pháp nhuộm miễn dịch mô học sử dụng kháng thể chính β-tubulin và kháng thể thứ cấp liên hợp với Alexa Fluor. Thanh tỷ lệ = 10 µm. (c) Cấu trúc nguyên phân của các vi ống trong mô phân sinh rễ. Các vi ống được hình dung bằng phương pháp nhuộm miễn dịch mô học. Các cấu trúc nguyên phân, bao gồm vùng tiền kỳ, thoi phân bào và tế bào thực vật, được đếm từ hình ảnh cộng hưởng. Các mũi tên chỉ ra các cấu trúc vi ống nguyên phân. Các dấu hoa thị chỉ ra sự khác biệt đáng kể với phương pháp xử lý giả (kiểm định t, p< 0,05).9. Thanh tỷ lệ = 50 µm.
Mặc dù Ursa có khả năng phá vỡ chức năng của vi ống, cơ chế hoạt động của nó được cho là khác với các tác nhân khử trùng vi ống thông thường. Ví dụ, nồng độ cao hơn của các tác nhân khử trùng vi ống như disopyramide và oryzalin gây ra sự giãn nở dị hướng của các tế bào biểu bì, trong khi KAND 11 thì không. Ngoài ra, việc áp dụng đồng thời KAND 11 và disopyramide dẫn đến phản ứng tăng trưởng rễ kết hợp do disopyramide gây ra và sự ức chế tăng trưởng do KAND 11 gây ra đã được quan sát thấy (Hình S4). Chúng tôi cũng đã phân tích phản ứng của đột biến disopyramide 1-1 (phs1-1) quá nhạy cảm với KAND 11. phs1-1 có đột biến điểm tubulin kinase không điển hình và tạo ra rễ ngắn hơn khi được xử lý bằng disopyramide9,20. Cây con đột biến phs1-1 được trồng trên môi trường thạch có chứa KAND 11 có rễ ngắn hơn tương tự như những cây được trồng trên disopyramid (hình S5).
Ngoài ra, chúng tôi quan sát thấy các cấu trúc vi ống nguyên phân, chẳng hạn như vùng tiền kỳ, thoi phân bào và phragmoplast, trong mô phân sinh rễ của cây con được xử lý bằng KAND 11. Phù hợp với các quan sát đối với CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, người ta quan sát thấy số lượng vi ống nguyên phân giảm đáng kể (Hình .6c).
Để mô tả độc tính tế bào của KAND 11 ở độ phân giải dưới tế bào, chúng tôi đã xử lý các tế bào huyền phù BY-2 thuốc lá bằng KAND 11 và quan sát phản ứng của chúng. Đầu tiên, chúng tôi thêm KAND 11 vào các tế bào BY-2 biểu hiện TagRFP-TUA6, chất gắn nhãn huỳnh quang cho các vi ống, để đánh giá tác dụng của KAND 11 lên các vi ống vỏ. Mật độ vi ống vỏ được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích hình ảnh, định lượng phần trăm các điểm ảnh của bộ xương tế bào trong số các điểm ảnh của tế bào chất. Kết quả xét nghiệm cho thấy sau khi xử lý bằng 50 μM hoặc 100 μM KAND 11 trong 1 giờ, mật độ giảm đáng kể xuống còn 0,94 ± 0,74% hoặc 0,23 ± 0,28%, trong khi mật độ của các tế bào được xử lý bằng DMSO đạt 1,61 ± 0,34% (Hình 7a). Những kết quả này phù hợp với quan sát ở Arabidopsis rằng xử lý KAND 11 gây ra sự khử trùng hợp của các vi ống vỏ (Hình 6b). Chúng tôi cũng đã kiểm tra dòng BY-2 với các sợi actin được gắn nhãn GFP-ABD sau khi xử lý bằng cùng nồng độ KAND 11 và quan sát thấy rằng xử lý KAND 11 đã phá vỡ các sợi actin. Xử lý bằng 50 μM hoặc 100 μM KAND 11 trong 1 giờ làm giảm đáng kể mật độ sợi actin xuống còn 1,20 ± 0,62% hoặc 0,61 ± 0,26%, trong khi mật độ ở các tế bào được xử lý bằng DMSO là 1,69 ± 0,51% (Hình 2). 7b). Những kết quả này trái ngược với tác dụng của propyzamide, không ảnh hưởng đến các sợi actin, và latrunculin B, một chất khử trùng hợp actin không ảnh hưởng đến các vi ống ( SI Hình S6). Ngoài ra, việc điều trị bằng coumamonamide 1, axit coumamonamide 6 hoặc KAND 11 không ảnh hưởng đến các vi ống trong tế bào HeLa (SI Hình S7). Do đó, cơ chế hoạt động của KAND 11 được cho là khác với cơ chế hoạt động của các chất phá vỡ bộ khung tế bào đã biết. Ngoài ra, quan sát dưới kính hiển vi của chúng tôi về các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 cho thấy sự khởi phát của quá trình chết tế bào trong quá trình xử lý KAND 11 và cho thấy tỷ lệ tế bào chết nhuộm xanh Evans không tăng đáng kể sau 30 phút xử lý KAND 11, trong khi sau 90 phút xử lý bằng 50 μM hoặc 100 μM KAND, số lượng tế bào chết tăng lên lần lượt là 43,7% hoặc 80,1% (Hình 7c). Tổng hợp lại, những dữ liệu này chỉ ra rằng dẫn xuất axit ursolic mới KAND 11 là chất ức chế bộ khung tế bào đặc hiệu của thực vật với cơ chế hoạt động trước đây chưa được biết đến.
KAND ảnh hưởng đến các vi ống vỏ, sợi actin và khả năng sống của tế bào BY-2 thuốc lá. (a) Hình ảnh vi ống vỏ trong tế bào BY-2 khi có TagRFP-TUA6. Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi cộng hưởng. Mật độ vi ống vỏ được tính toán từ các vi ảnh của 25 tế bào độc lập. Các chữ cái chỉ ra sự khác biệt đáng kể (kiểm tra Tukey HSD, p< 0,05). Thanh tỷ lệ = 10 µm. (b) Các sợi actin vỏ não trong tế bào BY-2 được hình dung khi có GFP-ABD2. Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi cộng hưởng. Mật độ các sợi actin vỏ não được tính toán từ các ảnh chụp vi mô của 25 tế bào độc lập. Các chữ cái chỉ ra sự khác biệt đáng kể (kiểm tra Tukey HSD, p< 0,05). Thanh tỷ lệ = 10 µm. (c) Quan sát tế bào BY-2 chết bằng phương pháp nhuộm xanh Evans. Tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi trường sáng. n=3. Thanh tỷ lệ = 100 µm.
Việc khám phá và ứng dụng các sản phẩm tự nhiên mới đã dẫn đến những tiến bộ đáng kể trong nhiều khía cạnh của đời sống con người, bao gồm y học và nông nghiệp. Nghiên cứu lịch sử đã được thực hiện để thu được các hợp chất hữu ích từ các nguồn tài nguyên thiên nhiên. Đặc biệt, xạ khuẩn được biết đến là hữu ích như thuốc kháng sinh chống ký sinh trùng cho giun tròn do khả năng sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp như avermectin, hợp chất chính của ivermectin và bleomycin cùng các dẫn xuất của nó, được sử dụng trong y học như một tác nhân chống ung thư21,22. Tương tự như vậy, nhiều hợp chất diệt cỏ đã được phát hiện từ xạ khuẩn, một số trong số đó đã được sử dụng thương mại1,23. Do đó, việc phân tích các chất chuyển hóa của xạ khuẩn để phân lập các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mong muốn được coi là một chiến lược hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới, coumamonamide, từ S. werraensis và đã tổng hợp thành công hợp chất này. Axit ursonic là chất trung gian tổng hợp của urbenamide và các dẫn xuất của nó. Nó có thể gây ra tình trạng rễ cong đặc trưng, thể hiện hoạt tính diệt cỏ từ trung bình đến mạnh và gây tổn thương trực tiếp hoặc gián tiếp đến các vi ống của cây. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của axit urmotonic có thể khác với cơ chế hoạt động của các chất ức chế vi ống hiện có, vì KAND 11 cũng phá vỡ các sợi actin và gây chết tế bào, cho thấy cơ chế điều hòa mà axit urmotonic và các dẫn xuất của nó ảnh hưởng đến nhiều cấu trúc bộ xương tế bào.
Đặc điểm chi tiết hơn về axit urbenonic sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của axit urbenonic. Đặc biệt, mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả năng liên kết của axit ursonic với các vi ống bị khử để xác định xem axit ursonic và các dẫn xuất của nó có tác động trực tiếp lên các vi ống và khử trùng hợp chúng hay không, hay liệu tác động của chúng có dẫn đến sự mất ổn định của vi ống hay không. Ngoài ra, trong trường hợp vi ống không phải là mục tiêu trực tiếp, việc xác định vị trí tác động và các mục tiêu phân tử của axit ursonic trên tế bào thực vật sẽ giúp hiểu rõ hơn về các đặc tính của các hợp chất liên quan và các cách có thể để cải thiện hoạt động diệt cỏ. Xét nghiệm hoạt tính sinh học của chúng tôi đã tiết lộ khả năng gây độc tế bào độc đáo của axit ursonic đối với sự phát triển của các loại cây như Arabidopsis thaliana, thuốc lá và rêu tản, trong khi cả tế bào E. coli và HeLa đều không bị ảnh hưởng. Ít hoặc không gây độc cho tế bào động vật là một lợi thế của các dẫn xuất axit ursonic nếu chúng được phát triển thành thuốc diệt cỏ để sử dụng trên các cánh đồng nông nghiệp mở. Thật vậy, vì vi ống là cấu trúc phổ biến ở sinh vật nhân chuẩn, nên việc ức chế chọn lọc chúng ở thực vật là một yêu cầu chính đối với thuốc diệt cỏ. Ví dụ, propyzamide, một tác nhân khử trùng vi ống liên kết trực tiếp với tubulin và ức chế quá trình trùng hợp, được sử dụng làm thuốc diệt cỏ do độc tính thấp đối với tế bào động vật24. Ngược lại với disopyramide, các benzamide liên quan có các đặc tính mục tiêu khác nhau. Ngoài các vi ống thực vật, RH-4032 hoặc benzoxamide cũng ức chế các vi ống của tế bào động vật hoặc oomycetes, và zalilamide được sử dụng làm thuốc diệt nấm do độc tính thực vật thấp25,26,27. Bear mới được phát hiện và các dẫn xuất của nó thể hiện độc tính tế bào chọn lọc đối với thực vật, nhưng cần lưu ý rằng các sửa đổi tiếp theo có thể làm thay đổi tính đặc hiệu mục tiêu của chúng, có khả năng cung cấp các dẫn xuất bổ sung để kiểm soát nấm gây bệnh hoặc oomycetes.
Các đặc tính độc đáo của axit urbenonic và các dẫn xuất của nó rất hữu ích cho quá trình phát triển của chúng như thuốc diệt cỏ và sử dụng làm công cụ nghiên cứu. Tầm quan trọng của bộ khung tế bào trong việc kiểm soát hình dạng tế bào thực vật đã được công nhận rộng rãi. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng thực vật đã phát triển các cơ chế phức tạp của tổ chức vi ống vỏ bằng cách kiểm soát động lực vi ống để kiểm soát đúng cách quá trình hình thái. Một số lượng lớn các phân tử chịu trách nhiệm điều chỉnh hoạt động của vi ống đã được xác định và các nghiên cứu liên quan vẫn đang được tiến hành3,4,28. Hiểu biết hiện tại của chúng ta về động lực vi ống trong tế bào thực vật không giải thích đầy đủ các cơ chế tổ chức vi ống vỏ. Ví dụ, mặc dù cả disopyramide và oryzalin đều có thể khử trùng các vi ống, disopyramide gây biến dạng rễ nghiêm trọng trong khi oryzalin có tác dụng tương đối nhẹ. Hơn nữa, các đột biến trong tubulin, chất ổn định vi ống, cũng gây ra sự quay sang phải ở rễ, trong khi paclitaxel, chất cũng ổn định động lực vi ống, thì không. Do đó, việc nghiên cứu và xác định các mục tiêu phân tử của axit ursolic sẽ cung cấp những hiểu biết mới về quá trình điều chỉnh vi ống vỏ thực vật. Tương tự như vậy, việc so sánh trong tương lai giữa các hóa chất có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự tăng trưởng méo mó, chẳng hạn như disopyramide, và các hóa chất kém hiệu quả hơn, chẳng hạn như oryzalin hoặc axit kumamotoric, sẽ cung cấp manh mối về cách thức xảy ra sự tăng trưởng méo mó.
Mặt khác, sự sắp xếp lại bộ khung tế bào liên quan đến phòng thủ là một khả năng khác để giải thích độc tính tế bào của axit ursonic. Nhiễm trùng của tác nhân gây bệnh hoặc đưa chất gây kích thích vào tế bào thực vật đôi khi gây ra sự phá hủy bộ khung tế bào và tế bào chết sau đó29. Ví dụ, cryptoxanthin có nguồn gốc từ oomycete đã được báo cáo là phá vỡ các vi ống và sợi actin trước khi tế bào thuốc lá chết, tương tự như những gì xảy ra với phương pháp điều trị KAND30,31. Những điểm tương đồng giữa phản ứng phòng thủ và phản ứng tế bào do axit ursonic gây ra khiến chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng chúng kích hoạt các quá trình tế bào chung, mặc dù axit ursonic có tác dụng nhanh hơn và mạnh hơn cryptoxanthin là rõ ràng. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phá vỡ các sợi actin thúc đẩy tế bào chết tự phát, không phải lúc nào cũng đi kèm với sự phá vỡ vi ống29. Ngoài ra, vẫn chưa biết liệu tác nhân gây bệnh hay chất gây kích thích có gây ra sự phát triển rễ bị biến dạng hay không, như các dẫn xuất của axit ursonic. Do đó, kiến thức phân tử liên kết các phản ứng phòng thủ và bộ khung tế bào là một vấn đề hấp dẫn cần được giải quyết. Bằng cách khai thác sự hiện diện của các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp liên quan đến axit ursonic, cũng như một loạt các dẫn xuất có hiệu lực khác nhau, họ có thể tạo ra cơ hội nhắm vào các cơ chế tế bào chưa biết.
Xét về tổng thể, việc khám phá và ứng dụng các hợp chất mới điều chỉnh động lực học của vi ống sẽ cung cấp các phương pháp mạnh mẽ để giải quyết các cơ chế phân tử phức tạp làm nền tảng cho việc xác định hình dạng tế bào thực vật. Trong bối cảnh này, hợp chất axit urmotonic mới được phát triển, có tác động đến vi ống và sợi actin và gây chết tế bào, có thể cung cấp cơ hội để giải mã mối liên hệ giữa quá trình kiểm soát vi ống và các cơ chế khác này. Do đó, phân tích hóa học và sinh học sử dụng axit urbenonic sẽ giúp chúng ta hiểu được các cơ chế điều hòa phân tử kiểm soát bộ khung tế bào thực vật.
Cấy S. werraensis MK493-CF1 vào bình Erlenmeyer có vách ngăn 500 mL chứa 110 mL môi trường hạt giống gồm 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) thành phần Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) chiết xuất ngô (KOGOSTCH Co., Ltd., Nhật Bản), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 và 0,2% CaCO3 trong nước khử ion. (pH 7,4 trước khi khử trùng). Các nền văn hóa hạt giống được ủ trên máy lắc quay (180 vòng/phút) ở 27°C trong 2 ngày. Nuôi cấy sản xuất thông qua quá trình lên men trạng thái rắn. Nuôi cấy hạt giống (7 ml) được chuyển vào bình K-1 500 ml chứa 40 g môi trường sản xuất gồm 15 g lúa mạch ép (MUSO Co., Ltd., Nhật Bản) và 25 g nước khử ion (pH không được điều chỉnh trước khi khử trùng). Quá trình lên men được thực hiện ở 30 ° C trong bóng tối trong 14 ngày. Vật liệu lên men được chiết xuất bằng 40 ml/chai EtOH và ly tâm (1500 g, 4 ° C, 10 phút). Dịch nuôi cấy trong (60 ml) được chiết xuất bằng hỗn hợp 10% MeOH/EtOAc. Lớp hữu cơ được bốc hơi dưới áp suất giảm để thu được cặn (59,5 mg), sau đó tiến hành HPLC với rửa giải theo phương pháp gradient (0–10 phút: 90%) trên cột pha đảo ngược (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × chiều dài 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 phút: 90% H2O/CH3CN đến 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 phút: 90% H2O/EtOH, 45–155 phút: 90% H2O/EtOH đến 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 phút: 100% EtOH) ở tốc độ dòng chảy 1,5 ml/phút, coumamonamide (1, 36,0 mg) được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ giá trị tính toán: 141,0659, giá trị đo được: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Hạt giống Columbia (Col-0) được lấy từ Trung tâm Tài nguyên Sinh học Arabidopsis (ABRC) với sự cho phép sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Hạt giống Col-0 được nhân giống và duy trì trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi và được sử dụng làm cây Arabidopsis loại hoang dã. Hạt giống Arabidopsis được khử trùng bề mặt và nuôi cấy trong môi trường Murashige và Skoog nửa nồng độ có chứa 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) axit 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) và 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ở 23 °C và ánh sáng liên tục. Hạt giống của đột biến phs1-1 được cung cấp bởi T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara).
Hạt giống của chủng SR-1 được cung cấp bởi T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara) và được sử dụng làm cây thuốc lá hoang dã. Hạt thuốc lá được khử trùng bề mặt và ngâm trong nước vô trùng trong ba đêm để thúc đẩy nảy mầm, sau đó được đặt trong dung dịch nửa nồng độ chứa 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES và 0,8% gellan gum (môi trường Murashige. và Skoog của Fujifilm Wako Pure Chemical) với pH 5,7 và ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Chủng Tak-1 do T. Kohchi (Đại học Kyoto) cung cấp và được sử dụng làm đơn vị thử nghiệm tiêu chuẩn cho nghiên cứu về rêu tản. Gemma được lấy từ cây nuôi cấy đã khử trùng và sau đó được cấy trên môi trường Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) chứa 1% sucrose và 0,3% gellan gum và ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Tế bào BY-2 thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) được cung cấp bởi S. Hasezawa (Đại học Tokyo). Tế bào BY-2 được pha loãng 95 lần trong môi trường Linsmeier và Skoog đã được biến đổi và bổ sung hàng tuần bằng axit 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 . Dung dịch tế bào được trộn trên máy lắc quay ở tốc độ 130 vòng/phút ở 27°C trong bóng tối. Rửa tế bào bằng 10 lần thể tích môi trường mới và huyền phù lại trong cùng môi trường. Dòng tế bào chuyển gen BY-2 biểu hiện ổn định dấu hiệu vi ống TagRFP-TUA6 hoặc dấu hiệu sợi actin GFP-ABD2 dưới sự thúc đẩy của vi rút khảm súp lơ 35S đã được tạo ra như mô tả33,34,35. Những dòng tế bào này có thể được duy trì và đồng bộ hóa bằng các quy trình tương tự như những quy trình được sử dụng cho dòng tế bào BY-2 ban đầu.
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified Eagle (DMEM) (Life Technologies) bổ sung 10% huyết thanh bò, 1,2 U/ml penicillin và 1,2 μg/ml streptomycin trong tủ ấm 37°C với 5% CO2.
Tất cả các thí nghiệm được mô tả trong bản thảo này đều được thực hiện theo các quy định và hướng dẫn về an toàn sinh học của Nhật Bản.
Hợp chất được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) dưới dạng dung dịch gốc và pha loãng trong môi trường MS đối với Arabidopsis và thuốc lá hoặc môi trường Gamborg B5 đối với rêu tản. Đối với xét nghiệm ức chế sinh trưởng rễ, hơn 10 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch có chứa các hợp chất đã chỉ định hoặc DMSO. Hạt được ủ trong buồng tăng trưởng trong 7 ngày. Cây con được chụp ảnh và chiều dài của rễ được đo. Đối với xét nghiệm nảy mầm Arabidopsis, 48 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch có chứa 200 μM hợp chất hoặc DMSO. Hạt Arabidopsis được trồng trong buồng tăng trưởng và số lượng cây con nảy mầm được đếm 7 ngày sau khi nảy mầm (dag). Đối với xét nghiệm nảy mầm thuốc lá, 24 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch có chứa 200 μM KAND hoặc DMSO. Hạt thuốc lá được trồng trong buồng tăng trưởng và số lượng cây con nảy mầm được đếm sau 14 ngày. Đối với thử nghiệm ức chế sự phát triển của địa tiền, 9 phôi từ mỗi đĩa được cấy trên môi trường thạch chứa nồng độ KAND hoặc DMSO đã chỉ định và ủ trong buồng tăng trưởng trong 14 ngày.
Sử dụng cây con nhuộm bằng 5 mg/ml propidium iodide (PI) để hình dung tổ chức mô phân sinh rễ. Tín hiệu PI được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang sử dụng kính hiển vi quét laser cộng hưởng TCS SPE (Leica Microsystems).
Nhuộm mô học rễ bằng β-glucuronidase (GUS) được thực hiện theo giao thức do Malami và Benfey36 mô tả. Cây con được cố định trong acetone 90% qua đêm, nhuộm bằng 0,5 mg/ml axit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic trong đệm GUS trong 1 giờ và đặt trong dung dịch chloraldehyde ngậm nước. (8 g chloral hydrate, 2 ml nước và 1 ml glycerol) và quan sát bằng kính hiển vi tương phản giao thoa vi sai sử dụng kính hiển vi Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Góc rễ được đo trên cây con 7 ngày tuổi được trồng trên các đĩa đặt thẳng đứng. Đo góc rễ theo hướng của vectơ trọng lực như mô tả ở bước 6.
Sự sắp xếp của các vi ống vỏ não được quan sát như đã mô tả, với những sửa đổi nhỏ đối với giao thức 37. Kháng thể anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) và kháng thể IgG chuột liên hợp Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) được sử dụng làm kháng thể chính và kháng thể phụ ở độ pha loãng lần lượt là 1:1000 và 1:100. Hình ảnh huỳnh quang được thu thập bằng kính hiển vi quét laser cộng hưởng TCS SPE (Leica Microsystems). Thu thập hình ảnh Z-stack và tạo các phép chiếu cường độ tối đa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Xét nghiệm tăng sinh tế bào HeLa được thực hiện bằng Bộ đếm tế bào 8 (Dojindo) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sự phát triển của E. coli DH5α được phân tích bằng cách đo mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ ở bước sóng 600 nm (OD600).
Tổ chức bộ xương tế bào trong tế bào BY-2 chuyển gen được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang được trang bị thiết bị quét cộng hưởng CSU-X1 (Yokogawa) và camera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Mật độ bộ xương tế bào được đánh giá bằng phân tích hình ảnh, định lượng phần trăm các điểm ảnh bộ xương tế bào trong số các điểm ảnh tế bào chất trong hình ảnh cộng hưởng bằng phần mềm ImageJ như đã mô tả38,39.
Để phát hiện tế bào chết trong tế bào BY-2, một phần nhỏ của hỗn dịch tế bào được ủ với 0,05% Evans blue trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Việc nhuộm Evans blue chọn lọc các tế bào chết phụ thuộc vào việc đẩy thuốc nhuộm ra khỏi các tế bào sống bằng màng huyết tương nguyên vẹn40. Các tế bào nhuộm được quan sát bằng kính hiển vi trường sáng (BX53, Olympus).
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS trong tủ ấm có độ ẩm ở 37°C và 5% CO2. Các tế bào được xử lý bằng 100 μM KAND 11, axit kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) hoặc 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) trong 6 giờ ở 37°C. Các tế bào được cố định bằng MetOH trong 10 phút và sau đó bằng acetate trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào cố định được ủ với kháng thể chính β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) pha loãng trong 0,5% BSA/PBS trong 2 giờ, rửa 3 lần bằng TBST, sau đó ủ với kháng thể dê Alexa Fluor. 488 1 giờ. – Chuột IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) và 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pha loãng trong 0,5% BSA/PBS. Sau khi rửa bằng TBST ba lần, các tế bào nhuộm màu được quan sát trên kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipse Ti-E. Hình ảnh được chụp bằng camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 đã làm mát bằng phần mềm MetaMorph (Thiết bị phân tử).
Thời gian đăng: 17-06-2024