Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản trình duyệt mới hơn (hoặc tắt Chế độ Tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng hoặc JavaScript.
Việc khám phá và sử dụng có lợi các sản phẩm tự nhiên có thể giúp cải thiện cuộc sống con người. Các hóa chất ức chế sinh trưởng thực vật được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt cỏ để kiểm soát cỏ dại. Do nhu cầu sử dụng các loại thuốc diệt cỏ khác nhau, việc xác định các hợp chất có cơ chế hoạt động mới là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất N-alkoxypyrrole mới, coumamonamide, từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và thiết lập quy trình tổng hợp hoàn chỉnh. Thông qua các thử nghiệm hoạt tính sinh học, chúng tôi phát hiện ra rằng axit urs-monoamic là một chất trung gian tổng hợp của urs-monoamide và là một chất tiềm năng.chất ức chế sinh trưởng thực vậtNgoài ra, chúng tôi đã phát triển nhiều dẫn xuất axit urbenonic khác nhau, bao gồm dẫn xuất urbenyloxy (UDA), có hoạt tính diệt cỏ cao mà không ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của tế bào HeLa. Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng các dẫn xuất axit urmotonic phá vỡ các vi ống thực vật; ngoài ra, KAND còn ảnh hưởng đến các sợi actin và gây chết tế bào; Những tác động đa diện này khác với các chất ức chế vi ống đã biết và gợi ý một cơ chế hoạt động mới của axit ursonic, một lợi thế quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc diệt cỏ mới.
Việc khám phá và ứng dụng thực tiễn các sản phẩm tự nhiên có lợi và các dẫn xuất của chúng là một phương tiện cải thiện chất lượng cuộc sống con người. Các chất chuyển hóa thứ cấp do vi sinh vật, thực vật và côn trùng tạo ra đã dẫn đến những tiến bộ vượt bậc trong y học và nông nghiệp. Nhiều loại thuốc kháng sinh và thuốc chống bệnh bạch cầu đã được phát triển từ các sản phẩm tự nhiên. Ngoài ra, nhiều loạithuốc trừ sâuThuốc diệt nấm và thuốc diệt cỏ được chiết xuất từ các sản phẩm tự nhiên này để sử dụng trong nông nghiệp. Đặc biệt, thuốc diệt cỏ dại là công cụ quan trọng để tăng năng suất cây trồng trong nông nghiệp hiện đại, và nhiều loại hợp chất khác nhau đã được sử dụng thương mại. Một số quá trình tế bào ở thực vật, chẳng hạn như quang hợp, chuyển hóa axit amin, tổng hợp thành tế bào, điều hòa nguyên phân, truyền tín hiệu phytohormone, hoặc tổng hợp protein, được coi là mục tiêu điển hình của thuốc diệt cỏ. Các hợp chất ức chế chức năng vi ống là một nhóm thuốc diệt cỏ phổ biến ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của thực vật bằng cách tác động đến quá trình điều hòa nguyên phân2.
Vi ống là thành phần của bộ khung tế bào và được bảo tồn rộng rãi trong các tế bào nhân chuẩn. Dị hợp tử tubulin bao gồm α-tubulin và β-tubulin tạo thành các nguyên sợi vi ống tuyến tính, với 13 nguyên sợi tạo thành cấu trúc hình trụ. Vi ống đóng nhiều vai trò trong tế bào thực vật, bao gồm xác định hình dạng tế bào, phân chia tế bào và vận chuyển nội bào3,4. Tế bào thực vật chứa các vi ống bên dưới màng tế bào chất pha trung gian, và những vi ống vỏ này được cho là kiểm soát sự tổ chức của các vi sợi cellulose thông qua việc điều hòa các phức hợp synthase cellulose4,5. Vi ống vỏ của các tế bào biểu bì rễ, hiện diện trong vùng kéo dài nhanh chóng của chóp rễ, nằm ở bên, và các sợi vi cellulose theo sau các vi ống này và hạn chế hướng mở rộng tế bào, do đó thúc đẩy sự kéo dài tế bào dị hướng. Do đó, chức năng của vi ống có liên quan chặt chẽ đến hình thái thực vật. Sự thay thế axit amin trong các gen mã hóa tubulin gây ra sự lệch của các mảng vi ống vỏ và sự tăng trưởng lệch về bên trái hoặc bên phải ở Arabidopsis 6,7. Tương tự, các đột biến trong các protein liên kết với vi ống điều chỉnh động lực học của vi ống cũng có thể dẫn đến sự phát triển rễ bị biến dạng8,9,10,11,12,13. Ngoài ra, việc xử lý bằng thuốc diệt cỏ gây rối loạn vi ống như disopyramide, còn được gọi là pretilachlor, cũng gây ra sự phát triển rễ xiên về bên trái14. Những dữ liệu này chỉ ra rằng việc điều chỉnh chính xác chức năng của vi ống là rất quan trọng để xác định hướng tăng trưởng của cây.
Nhiều loại chất ức chế vi ống đã được phát hiện, và những loại thuốc này đã có những đóng góp đáng kể cho nghiên cứu bộ khung tế bào, cũng như cho nông nghiệp và y học2. Đặc biệt, các hợp chất oryzalin, dinitroaniline, disopyramide, các hợp chất liên quan đến benzamide và các chất tương tự của chúng có thể ức chế chức năng vi ống và do đó ức chế sự sinh trưởng của thực vật. Do đó, chúng được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt cỏ. Tuy nhiên, vì vi ống là một thành phần quan trọng của tế bào thực vật và động vật, hầu hết các chất ức chế vi ống đều gây độc tế bào đối với cả hai loại tế bào. Do đó, mặc dù được công nhận là thuốc diệt cỏ, một số lượng hạn chế các chất chống vi ống được sử dụng cho các mục đích thực tế.
Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomyces, bao gồm vi khuẩn dạng sợi, gram dương, hiếu khí và được biết đến rộng rãi nhờ khả năng sản xuất nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp. Do đó, nó được coi là một trong những nguồn quan trọng nhất của các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mới. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới gọi là coumamonamide, được phân lập từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và S. werraensis ISP 5486. Sử dụng phân tích phổ và phân tích phổ đầy đủ, cấu trúc của coumamonamide đã được mô tả và bộ khung N-alkoxypyrrole độc đáo của nó đã được xác định. Tổng hợp. Axit ursmonic, một chất trung gian tổng hợp của ursmonoamide và các dẫn xuất của nó, đã được phát hiện có tác dụng ức chế sự phát triển và nảy mầm của cây mẫu phổ biến Arabidopsis thaliana. Trong một nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính, chúng tôi phát hiện ra rằng một hợp chất với C9 được biến đổi thành axit ursonic, được gọi là dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (KAND), làm tăng đáng kể tác dụng ức chế sự phát triển và nảy mầm. Đáng chú ý, chất ức chế sinh trưởng thực vật mới được phát hiện cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây thuốc lá và địa tiền, nhưng không gây độc tế bào đối với vi khuẩn hoặc tế bào HeLa. Hơn nữa, một số dẫn xuất của axit urmotonic gây ra kiểu hình rễ bị biến dạng, ngụ ý rằng các dẫn xuất này ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến các vi ống. Phù hợp với ý tưởng này, các quan sát của chúng tôi về các vi ống được đánh dấu bằng phương pháp miễn dịch mô hóa học hoặc bằng protein huỳnh quang cho thấy xử lý KAND làm mất trùng hợp các vi ống. Ngoài ra, xử lý bằng các dẫn xuất của axit kumamotonic đã phá vỡ các vi sợi actin. Do đó, chúng tôi đã phát hiện ra một chất ức chế sinh trưởng thực vật mới có cơ chế hoạt động độc đáo liên quan đến việc phá hủy bộ khung tế bào.
Chủng MK493-CF1 được phân lập từ đất ở Shinagawa-ku, Tokyo. Chủng MK493-CF1 hình thành nên sợi nấm mô đệm phân nhánh tốt. Trình tự một phần của gen RNA ribosome 16S (1422 bp) đã được xác định. Chủng này rất giống với S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: chủng điển hình, 99,93%). Dựa trên kết quả này, người ta xác định rằng chủng này có quan hệ họ hàng gần với chủng điển hình của S. werraensis. Do đó, chúng tôi tạm thời đặt tên cho chủng này là S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T cũng sản xuất ra các hợp chất hoạt tính sinh học tương tự. Vì có rất ít nghiên cứu ban đầu về việc thu được các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật này, nên các nghiên cứu hóa học sâu hơn đã được tiến hành. Sau khi nuôi cấy S. werraensis MK493-CF1 trên môi trường đại mạch bằng phương pháp lên men thể rắn ở 30°C trong 14 ngày, môi trường được chiết xuất bằng 50% EtOH. 60 ml mẫu được sấy khô để thu được 59,5 mg dịch chiết thô. Dịch chiết thô được phân tích bằng HPLC pha đảo để thu được N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, có tên là coumamonamide, 36,0 mg). Tổng lượng 1 chiếm khoảng 60% dịch chiết thô. Do đó, chúng tôi quyết định nghiên cứu chi tiết các đặc tính của kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 là bột vô định hình màu trắng và khối phổ phân giải cao (HRESIMS) xác nhận C6H8N2O2 (Hình 1). Đoạn pyrrole thay thế C2 của hợp chất này được đặc trưng bởi δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH trong phổ NMR 1H: 4,5 Hz, H-5) và δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), và phổ NMR 13C cho thấy sự hiện diện của bốn nguyên tử cacbon sp2. Sự hiện diện của một nhóm amide ở vị trí C2 được đánh giá bằng tương quan HMBC từ proton C-3 đến carbon carbonyl amide ở δC 161,1. Ngoài ra, các đỉnh NMR 1H và 13C tại δH 4,10 (3H, S) và δC 68,3 chỉ ra sự hiện diện của nhóm N-methoxy trong phân tử. Mặc dù vị trí chính xác của nhóm methoxy vẫn chưa được xác định bằng các phương pháp phân tích quang phổ như phổ chênh lệch nâng cao và phương pháp viết tắt Overhauser hạt nhân (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide đã trở thành hợp chất ứng cử viên đầu tiên.
Để xác định cấu trúc chính xác của 1, tổng hợp toàn phần đã được thực hiện (Hình 2a). Xử lý 2-aminopyridine 2 có bán trên thị trường bằng m-CPBA tạo ra N-oxide 3 tương ứng về năng suất định lượng. Sau khi 2-aminoazid hóa 2, phản ứng ngưng tụ cyclocondensation được Abramovich mô tả đã được thực hiện trong benzen ở 90°C để thu được 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 mong muốn tính bằng gam. Tốc độ 60% (hai giai đoạn). 15,16. Metyl hóa và thủy phân 4 sau đó tạo ra axit 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (gọi là "axit cumotonic", 6) với năng suất tốt (70%, hai bước). Cuối cùng, amid hóa thông qua chất trung gian clorua axit 6 sử dụng amoniac trong nước tạo ra Kumamoto amide 1 với năng suất 98%. Tất cả dữ liệu phổ của tổng hợp 1 đều tương tự như 1 đã phân lập, do đó cấu trúc của 1 đã được xác định;
Tổng hợp và phân tích chung hoạt tính sinh học của urbenamide và axit urbenic. (a) Tổng hợp toàn phần amide Kumamoto. (b) Cây giống Arabidopsis Columbia (Col) hoang dã bảy ngày tuổi được trồng trên đĩa Murashige và Skoog (MS) chứa coumamonamide 6 hoặc coumamonamide 1 ở nồng độ đã chỉ định. Thanh tỷ lệ = 1 cm.
Đầu tiên, chúng tôi đánh giá hoạt tính sinh học của urbenamide và các chất trung gian của nó về khả năng điều chỉnh sinh trưởng thực vật. Chúng tôi đã bổ sung ursmonamide 1 hoặc axit ursmonic 6 ở các nồng độ khác nhau vào môi trường thạch MS và nuôi cấy cây con Arabidopsis thaliana trên môi trường này. Các xét nghiệm này cho thấy nồng độ cao (500 μM) của 6 đã ức chế sự phát triển của rễ (Hình 2b). Tiếp theo, chúng tôi tạo ra các dẫn xuất khác nhau bằng cách thay thế vị trí N1 của 6 và thực hiện các nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính trên chúng (quy trình tổng hợp tương tự được mô tả trong Thông tin Bổ sung (SI)). Cây con Arabidopsis được trồng trên môi trường chứa 50 μM dẫn xuất axit ursonic, và chiều dài rễ được đo như trong hình. Như thể hiện trong Hình 3a, b và S1, axit coumamo có độ dài chuỗi alkoxy tuyến tính khác nhau (9, 10, 11, 12 và 13) hoặc chuỗi alkoxy lớn (15, 16 và 17) ở vị trí N1. Các dẫn xuất này cho thấy sự ức chế đáng kể sự phát triển của rễ. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy việc sử dụng 200 μM 10, 11 hoặc 17 đã ức chế sự nảy mầm (Hình 3c và S2).
Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính của amide Kumamoto và các hợp chất liên quan. (a) Cấu trúc và sơ đồ tổng hợp các chất tương tự. (b) Định lượng chiều dài rễ của cây con 7 ngày tuổi được trồng trên môi trường MS có hoặc không có dẫn xuất coumamonamide 50 μM. Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa xử lý giả dược (kiểm định t, p< 0,05).18. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. nt nghĩa là “chưa thử nghiệm” vì hơn 50% hạt không nảy mầm. (c) Định lượng tỷ lệ nảy mầm của hạt đã xử lý được ủ trong môi trường MS có hoặc không có 200 μM coumamonamide và các hợp chất liên quan trong 7 ngày. Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt đáng kể so với xử lý giả dược (kiểm định chi bình phương). n=96.
Điều thú vị là việc bổ sung các chuỗi bên alkyl dài hơn C9 đã làm giảm hoạt động ức chế, cho thấy các hợp chất liên quan đến axit kumamotoic cần các chuỗi bên có kích thước nhất định để thể hiện hoạt động sinh học của chúng.
Do phân tích mối quan hệ cấu trúc-hoạt động cho thấy C9 đã được biến đổi thành axit ursonic và dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (sau đây gọi là KAND 11) là chất ức chế sinh trưởng thực vật hiệu quả nhất, chúng tôi đã tiến hành mô tả chi tiết hơn về KAND 11. Xử lý Arabidopsis bằng KAND 11 50 μM gần như ngăn chặn hoàn toàn sự nảy mầm, trong khi nồng độ thấp hơn (40, 30, 20 hoặc 10 μM) KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 4a, b). Để kiểm tra xem KAND 11 có ảnh hưởng đến khả năng sống của mô phân sinh rễ hay không, chúng tôi đã kiểm tra mô phân sinh rễ được nhuộm bằng propidium iodide (PI) và đo kích thước diện tích mô phân sinh. Kích thước mô phân sinh của cây con được trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND-11 là 151,1 ± 32,5 μm, trong khi kích thước mô phân sinh của cây con được trồng trên môi trường đối chứng chứa DMSO là 264,7 ± 30,8 μm (Hình 4c, d), cho thấy KAND-11 phục hồi hoạt động của tế bào. lan rộng. Mô phân sinh rễ. Phù hợp với điều này, xử lý KAND 11 làm giảm lượng tín hiệu của dấu hiệu phân chia tế bào CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS trong mô phân sinh rễ (Hình 4e) 17 . Những kết quả này chỉ ra rằng KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ bằng cách làm giảm hoạt động tăng sinh tế bào.
Phân tích tác dụng ức chế của các dẫn xuất axit urbenonic (dẫn xuất urbenyloxy) lên sự sinh trưởng. (a) Cây giống Col hoang dã 7 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS với nồng độ KAND 11 đã chỉ định. Thanh tỷ lệ = 1 cm. (b) Định lượng chiều dài rễ. Các chữ cái biểu thị sự khác biệt đáng kể (thử nghiệm Tukey HSD, p< 0,05).16. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. (c) Kính hiển vi cộng tiêu của rễ Col hoang dã nhuộm propidium iodide được trồng trên đĩa MS có hoặc không có KAND 25 μM. 11. Dấu ngoặc trắng biểu thị mô phân sinh rễ. Thanh tỷ lệ = 100 µm. (d) Định lượng kích thước mô phân sinh rễ (n = 10 đến 11). Sự khác biệt thống kê được xác định bằng kiểm định t (p< 0,05). Các thanh biểu thị kích thước mô phân sinh trung bình. (e) Kính hiển vi tương phản giao thoa khác biệt (DIC) của mô phân sinh rễ chứa cấu trúc CDKB2; 1pro: CDKB2; nhuộm 1-GUS và nhuộm trên cây con 5 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS có hoặc không có xét nghiệm KAND 25 µM.
Độc tính thực vật của KAND 11 đã được thử nghiệm thêm bằng cách sử dụng một loại cây hai lá mầm khác là thuốc lá (Nicotiana tabacum), và một sinh vật mô hình thực vật trên cạn chính là rêu tản (Marchantia polymorpha). Giống như trường hợp của Arabidopsis, cây giống thuốc lá SR-1 được trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND 11 đã tạo ra rễ ngắn hơn (Hình 5a). Ngoài ra, 40 trong số 48 hạt đã nảy mầm trên các đĩa chứa 200 μM KAND 11, trong khi tất cả 48 hạt đều nảy mầm trên môi trường xử lý giả, cho thấy nồng độ KAND cao hơn có ý nghĩa thống kê (p< 0,05; kiểm định chi bình phương) ức chế sự nảy mầm của thuốc lá. (Hình 5b). Ngoài ra, nồng độ KAND 11 ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong tản nhiệt tương tự như nồng độ hiệu quả trong Arabidopsis (Hình 5c). Những kết quả này chỉ ra rằng KAND 11 có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại thực vật. Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các hợp chất liên quan đến monoamide ở gấu trong các sinh vật khác, cụ thể là tế bào HeLa của người và chủng Escherichia coli DH5α, lần lượt là đại diện của tế bào động vật bậc cao và tế bào vi khuẩn. Trong một loạt các xét nghiệm tăng sinh tế bào, chúng tôi quan sát thấy coumamonamide 1, axit coumamonamidic 6 và KAND 11 không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào HeLa hoặc E. coli ở nồng độ 100 μM (Hình 5d,e).
Ức chế sự tăng trưởng của KAND 11 ở các sinh vật không phải Arabidopsis. (a) Cây giống thuốc lá SR-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên các đĩa MS được đặt theo chiều dọc chứa 25 μM KAND 11. (b) Cây giống thuốc lá SR-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên các đĩa MS được đặt theo chiều ngang chứa 200 μM KAND 11. (c) Nụ địa tiền Tak-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên các đĩa Gamborg B5 với nồng độ KAND 11 được chỉ định. Mũi tên đỏ chỉ ra các bào tử ngừng phát triển trong thời gian ủ hai tuần. (d) Xét nghiệm tăng sinh tế bào của tế bào HeLa. Số lượng tế bào sống được đo theo các khoảng thời gian cố định bằng bộ đếm tế bào 8 (Dojindo). Để kiểm soát, các tế bào HeLa được xử lý bằng 5 μg/ml actinomycin D (Act D), chất ức chế phiên mã RNA polymerase và gây chết tế bào. Các phân tích được thực hiện theo bộ ba. (e) Xét nghiệm tăng sinh tế bào E. coli. Sự phát triển của E. coli được phân tích bằng cách đo OD600. Đối chứng, tế bào được xử lý bằng ampicillin (Amp) 50 μg/ml, chất ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Các phân tích được thực hiện ba lần.
Để giải mã cơ chế hoạt động của độc tính tế bào do các hợp chất liên quan đến uramide gây ra, chúng tôi đã phân tích lại các dẫn xuất của axit urbenic có tác dụng ức chế vừa phải. như được thể hiện trên hình. Như thể hiện trong Hình 2b, 6a, cây con được trồng trên đĩa thạch chứa nồng độ cao (200 μM) axit urmotonic 6 tạo ra rễ ngắn hơn và cong về bên trái (θ = - 23,7 ± 6,1), trong khi đối với cây con được trồng trên môi trường đối chứng, cây con tạo ra rễ gần như thẳng (θ = - 3,8 ± 7,1). Sự phát triển xiên đặc trưng này được biết là kết quả của rối loạn chức năng của các vi ống vỏ14,18. Phù hợp với phát hiện này, các thuốc làm mất ổn định vi ống disopyramide và oryzalin đã gây ra sự nghiêng rễ tương tự trong điều kiện phát triển của chúng tôi (Hình 2b, 6a). Đồng thời, chúng tôi đã thử nghiệm các dẫn xuất của axit urmotonic và chọn ra một số dẫn xuất trong số đó, ở một số nồng độ nhất định, gây ra sự phát triển rễ xiên. Hợp chất 8, 9 và 15 đã thay đổi hướng phát triển của rễ ở nồng độ lần lượt là 75 μM, 50 μM và 40 μM, cho thấy các hợp chất này có thể làm mất ổn định các vi ống một cách hiệu quả (Hình 2b, 6a). Chúng tôi cũng đã thử nghiệm dẫn xuất axit ursolic mạnh nhất, KAND 11, ở nồng độ thấp hơn (15 µM) và phát hiện ra rằng việc sử dụng KAND 11 đã ức chế sự phát triển của rễ và hướng phát triển của rễ không đồng đều, mặc dù chúng có xu hướng nghiêng về bên trái (Hình C3). . Vì nồng độ cao hơn của các loại thuốc làm mất ổn định vi ống đôi khi ức chế sự phát triển của cây thay vì gây ra sự nghiêng của rễ, sau đó chúng tôi đã đánh giá khả năng KAND 11 ảnh hưởng đến các vi ống bằng cách quan sát các vi ống vỏ trong các tế bào biểu bì rễ. Miễn dịch mô hóa học sử dụng kháng thể kháng β-tubulin trong tế bào biểu bì rễ cây con được xử lý bằng KAND 11 25 μM cho thấy hầu hết các vi ống vỏ trong tế bào biểu bì ở vùng kéo dài đã biến mất (Hình 6b). Những kết quả này cho thấy axit kumamotonic và các dẫn xuất của nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên các vi ống để phá vỡ chúng và các hợp chất này là những chất ức chế vi ống mới.
Axit ursonic và các dẫn xuất của nó làm thay đổi các vi ống vỏ rễ ở Arabidopsis thaliana. (a) Góc nghiêng của rễ được đo khi có sự hiện diện của các dẫn xuất axit ursonic khác nhau ở nồng độ được chỉ định. Tác động của hai hợp chất được biết là ức chế vi ống: disopyramide và oryzalin cũng đã được phân tích. Hình chèn cho thấy tiêu chuẩn được sử dụng để đo góc sinh trưởng của rễ. Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa xử lý giả dược (kiểm định t, p< 0,05).19. Thanh tỷ lệ = 1 cm. (b) Các vi ống vỏ trong tế bào biểu bì ở vùng kéo dài. Các vi ống trong rễ cây Arabidopsis Col hoang dã được nuôi cấy trên đĩa MS có hoặc không có 25 μM KAND 11 được quan sát bằng phương pháp nhuộm miễn dịch mô học sử dụng kháng thể sơ cấp β-tubulin và kháng thể thứ cấp liên hợp Alexa Fluor. Thanh tỷ lệ = 10 μm. (c) Cấu trúc nguyên phân của các vi ống trong mô phân sinh rễ. Các vi ống được quan sát bằng phương pháp nhuộm miễn dịch mô học. Các cấu trúc nguyên phân, bao gồm vùng tiền kỳ, thoi phân bào và tế bào thực vật, được đếm từ hình ảnh cộng hưởng. Mũi tên chỉ cấu trúc vi ống nguyên phân. Dấu hoa thị chỉ ra sự khác biệt đáng kể giữa xử lý giả (kiểm định t, p< 0,05).9. Thanh tỷ lệ = 50 µm.
Mặc dù Ursa có khả năng phá vỡ chức năng vi ống, cơ chế hoạt động của nó được cho là khác với các tác nhân khử trùng vi ống thông thường. Ví dụ, nồng độ cao hơn của các tác nhân khử trùng vi ống như disopyramide và oryzalin gây ra sự giãn nở dị hướng của các tế bào biểu bì, trong khi KAND 11 thì không. Ngoài ra, việc áp dụng đồng thời KAND 11 và disopyramide dẫn đến phản ứng tăng trưởng rễ do disopyramide kết hợp và sự ức chế tăng trưởng do KAND 11 gây ra đã được quan sát thấy (Hình S4). Chúng tôi cũng đã phân tích phản ứng của đột biến disopyramide 1-1 (phs1-1) quá mẫn cảm với KAND 11. phs1-1 có đột biến điểm tubulin kinase không điển hình và tạo ra rễ ngắn hơn khi được xử lý bằng disopyramide9,20. Cây con đột biến phs1-1 được trồng trên môi trường thạch có chứa KAND 11 có rễ ngắn hơn tương tự như những cây được trồng trên disopyramid (hình S5).
Ngoài ra, chúng tôi đã quan sát thấy các cấu trúc vi ống nguyên phân, chẳng hạn như vùng tiền kỳ, thoi phân bào và phragmoplast, trong mô phân sinh rễ của cây con được xử lý bằng KAND 11. Phù hợp với các quan sát đối với CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, người ta đã quan sát thấy số lượng vi ống nguyên phân giảm đáng kể (Hình .6c).
Để xác định độc tính tế bào của KAND 11 ở độ phân giải dưới tế bào, chúng tôi đã xử lý tế bào huyền phù BY-2 thuốc lá bằng KAND 11 và quan sát phản ứng của chúng. Đầu tiên, chúng tôi thêm KAND 11 vào tế bào BY-2 biểu hiện TagRFP-TUA6, là chất đánh dấu huỳnh quang các vi ống, để đánh giá tác dụng của KAND 11 lên các vi ống vỏ. Mật độ vi ống vỏ được đánh giá bằng phân tích hình ảnh, định lượng tỷ lệ phần trăm các điểm ảnh của bộ xương tế bào so với các điểm ảnh của tế bào chất. Kết quả xét nghiệm cho thấy sau khi xử lý bằng KAND 11 50 μM hoặc 100 μM trong 1 giờ, mật độ giảm đáng kể xuống còn 0,94 ± 0,74% hoặc 0,23 ± 0,28%, trong khi mật độ tế bào được xử lý bằng DMSO đạt 1,61 ± 0,34% (Hình 7a). Những kết quả này phù hợp với quan sát trên cây Arabidopsis rằng xử lý KAND 11 gây ra sự khử trùng hợp của các vi ống vỏ (Hình 6b). Chúng tôi cũng đã kiểm tra dòng BY-2 với các sợi actin được gắn nhãn GFP-ABD sau khi xử lý với cùng nồng độ KAND 11 và quan sát thấy rằng xử lý KAND 11 đã phá vỡ các sợi actin. Xử lý bằng KAND 11 50 μM hoặc 100 μM trong 1 giờ làm giảm đáng kể mật độ sợi actin xuống còn 1,20 ± 0,62% hoặc 0,61 ± 0,26%, trong khi mật độ ở các tế bào được xử lý bằng DMSO là 1,69 ± 0,51% (Hình 2). 7b). Những kết quả này trái ngược với tác dụng của propyzamide, chất không ảnh hưởng đến các sợi actin, và latrunculin B, chất khử trùng hợp actin không ảnh hưởng đến các vi ống (Hình S6 SI). Ngoài ra, việc điều trị bằng coumamonamide 1, axit coumamonamide 6 hoặc KAND 11 không ảnh hưởng đến các vi ống trong tế bào HeLa (SI Hình S7). Do đó, cơ chế hoạt động của KAND 11 được cho là khác với cơ chế hoạt động của các chất phá vỡ bộ khung tế bào đã biết. Ngoài ra, quan sát dưới kính hiển vi của chúng tôi về các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 cho thấy sự khởi phát của quá trình chết tế bào trong quá trình xử lý KAND 11 và cho thấy tỷ lệ tế bào chết nhuộm xanh Evans không tăng đáng kể sau 30 phút xử lý KAND 11, trong khi sau 90 phút xử lý bằng KAND 50 μM hoặc 100 μM, số lượng tế bào chết tăng lên lần lượt là 43,7% hoặc 80,1% (Hình 7c). Tổng hợp lại, những dữ liệu này chỉ ra rằng dẫn xuất axit ursolic mới KAND 11 là chất ức chế bộ khung tế bào đặc hiệu cho thực vật với cơ chế hoạt động chưa được biết trước đây.
KAND ảnh hưởng đến các vi ống vỏ, sợi actin và khả năng sống của tế bào BY-2 thuốc lá. (a) Hình ảnh vi ống vỏ trong tế bào BY-2 khi có TagRFP-TUA6. Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi cộng hưởng. Mật độ vi ống vỏ được tính toán từ ảnh chụp vi thể của 25 tế bào độc lập. Các chữ cái biểu thị sự khác biệt đáng kể (thử nghiệm Tukey HSD, p< 0,05). Thanh tỷ lệ = 10 µm. (b) Các sợi actin vỏ tế bào BY-2 được hình dung khi có sự hiện diện của GFP-ABD2. Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi cộng hưởng từ. Mật độ các sợi actin vỏ tế bào được tính toán từ ảnh chụp vi thể của 25 tế bào độc lập. Các chữ cái biểu thị sự khác biệt đáng kể (kiểm tra Tukey HSD, p< 0,05). Thanh tỷ lệ = 10 µm. (c) Quan sát tế bào BY-2 chết bằng phương pháp nhuộm xanh Evans. Tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 µM hoặc 100 µM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi trường sáng. n=3. Thanh tỷ lệ = 100 µm.
Việc khám phá và ứng dụng các sản phẩm tự nhiên mới đã dẫn đến những tiến bộ đáng kể trong nhiều khía cạnh của đời sống con người, bao gồm y học và nông nghiệp. Nhiều nghiên cứu lịch sử đã được thực hiện để thu được các hợp chất hữu ích từ tài nguyên thiên nhiên. Đặc biệt, xạ khuẩn được biết đến là một loại kháng sinh chống ký sinh trùng hữu ích cho giun tròn do khả năng sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp như avermectin, hợp chất chính của ivermectin và bleomycin cùng các dẫn xuất của nó, được sử dụng trong y học như một tác nhân chống ung thư21,22. Tương tự, nhiều hợp chất diệt cỏ đã được phát hiện từ xạ khuẩn, một số trong đó đã được sử dụng thương mại1,23. Do đó, việc phân tích các chất chuyển hóa của xạ khuẩn để phân lập các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mong muốn được coi là một chiến lược hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới, coumamonamide, từ S. werraensis và đã tổng hợp thành công. Axit Ursonic là một chất trung gian tổng hợp của urbenamide và các dẫn xuất của nó. Nó có thể gây ra hiện tượng quăn rễ đặc trưng, thể hiện hoạt tính diệt cỏ từ trung bình đến mạnh và gây tổn thương trực tiếp hoặc gián tiếp đến các vi ống của cây. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của axit urmotonic có thể khác với cơ chế hoạt động của các chất ức chế vi ống hiện có, vì KAND 11 cũng phá vỡ các sợi actin và gây chết tế bào, cho thấy cơ chế điều hòa mà axit urmotonic và các dẫn xuất của nó ảnh hưởng đến nhiều cấu trúc bộ xương tế bào.
Việc nghiên cứu chi tiết hơn về axit urbenonic sẽ giúp hiểu rõ hơn cơ chế hoạt động của axit urbenonic. Cụ thể, mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả năng liên kết của axit ursonic với các vi ống bị khử để xác định xem axit ursonic và các dẫn xuất của nó có tác động trực tiếp lên các vi ống và làm mất trùng hợp chúng hay không, hay liệu tác động của chúng có dẫn đến sự mất ổn định của vi ống hay không. Ngoài ra, trong trường hợp vi ống không phải là mục tiêu trực tiếp, việc xác định vị trí tác động và các mục tiêu phân tử của axit ursonic trên tế bào thực vật sẽ giúp hiểu rõ hơn về đặc tính của các hợp chất liên quan và các phương pháp khả thi để cải thiện hoạt tính diệt cỏ. Xét nghiệm hoạt tính sinh học của chúng tôi đã tiết lộ khả năng gây độc tế bào độc đáo của axit ursonic đối với sự phát triển của các loài thực vật như Arabidopsis thaliana, thuốc lá và rêu tản, trong khi cả tế bào E. coli và HeLa đều không bị ảnh hưởng. Ít hoặc không gây độc đối với tế bào động vật là một lợi thế của các dẫn xuất axit ursonic nếu chúng được phát triển làm thuốc diệt cỏ để sử dụng trên các cánh đồng nông nghiệp mở. Thật vậy, vì vi ống là cấu trúc phổ biến ở sinh vật nhân chuẩn, nên việc ức chế chọn lọc chúng ở thực vật là một yêu cầu quan trọng đối với thuốc diệt cỏ. Ví dụ, propyzamide, một tác nhân phá hủy vi ống liên kết trực tiếp với tubulin và ức chế quá trình trùng hợp, được sử dụng làm thuốc diệt cỏ do độc tính thấp đối với tế bào động vật24. Trái ngược với disopyramide, các benzamide cùng loại có tính đặc hiệu mục tiêu khác nhau. Ngoài vi ống thực vật, RH-4032 hoặc benzoxamide còn ức chế vi ống của tế bào động vật hoặc nấm oomycetes, và zalilamide được sử dụng làm thuốc diệt nấm do độc tính thực vật thấp25,26,27. Bear mới được phát hiện và các dẫn xuất của nó thể hiện độc tính tế bào chọn lọc đối với thực vật, nhưng cần lưu ý rằng các biến đổi tiếp theo có thể làm thay đổi tính đặc hiệu mục tiêu của chúng, có khả năng cung cấp thêm các dẫn xuất để kiểm soát nấm hoặc nấm oomycetes gây bệnh.
Các đặc tính độc đáo của axit urbenonic và các dẫn xuất của nó rất hữu ích cho việc phát triển chúng thành thuốc diệt cỏ và sử dụng làm công cụ nghiên cứu. Tầm quan trọng của bộ khung tế bào trong việc kiểm soát hình dạng tế bào thực vật đã được công nhận rộng rãi. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng thực vật đã phát triển các cơ chế phức tạp của tổ chức vi ống vỏ bằng cách kiểm soát động lực học của vi ống để kiểm soát hình thái học một cách thích hợp. Một số lượng lớn các phân tử chịu trách nhiệm điều hòa hoạt động của vi ống đã được xác định, và các nghiên cứu liên quan vẫn đang được tiến hành3,4,28. Hiểu biết hiện tại của chúng ta về động lực học của vi ống trong tế bào thực vật vẫn chưa giải thích đầy đủ các cơ chế tổ chức vi ống vỏ. Ví dụ, mặc dù cả disopyramide và oryzalin đều có thể khử trùng các vi ống, disopyramide gây biến dạng rễ nghiêm trọng trong khi oryzalin có tác dụng tương đối nhẹ. Hơn nữa, các đột biến trong tubulin, chất ổn định vi ống, cũng gây ra hiện tượng xoay phải ở rễ, trong khi paclitaxel, chất cũng ổn định động lực học của vi ống, thì không. Do đó, việc nghiên cứu và xác định các mục tiêu phân tử của axit ursolic sẽ cung cấp những hiểu biết mới về việc điều hòa các vi ống vỏ thực vật. Tương tự như vậy, việc so sánh trong tương lai giữa các hóa chất có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự phát triển méo mó, chẳng hạn như disopyramide, và các hóa chất ít hiệu quả hơn, chẳng hạn như oryzalin hoặc axit kumamotoric, sẽ cung cấp manh mối về cách thức xảy ra sự phát triển méo mó.
Mặt khác, sự sắp xếp lại bộ khung tế bào liên quan đến cơ chế phòng vệ là một khả năng khác để giải thích độc tính tế bào của axit ursonic. Nhiễm trùng tác nhân gây bệnh hoặc đưa chất kích thích vào tế bào thực vật đôi khi gây ra sự phá hủy bộ khung tế bào và dẫn đến chết tế bào sau đó29. Ví dụ, cryptoxanthin có nguồn gốc từ oomycete đã được báo cáo là phá vỡ các vi ống và sợi actin trước khi tế bào thuốc lá chết, tương tự như những gì xảy ra với điều trị KAND30,31. Sự tương đồng giữa phản ứng phòng vệ và phản ứng tế bào do axit ursonic gây ra đã dẫn chúng tôi đến giả thuyết rằng chúng kích hoạt các quá trình tế bào thông thường, mặc dù axit ursonic có tác dụng nhanh hơn và mạnh hơn cryptoxanthin. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phá vỡ các sợi actin thúc đẩy quá trình chết tế bào tự phát, điều này không phải lúc nào cũng đi kèm với sự phá vỡ vi ống29. Ngoài ra, vẫn còn phải xem liệu tác nhân gây bệnh hay chất kích thích có gây ra sự phát triển rễ bị biến dạng, như các dẫn xuất của axit ursonic hay không. Do đó, kiến thức phân tử liên kết các phản ứng phòng vệ và bộ khung tế bào là một vấn đề hấp dẫn cần được giải quyết. Bằng cách khai thác sự hiện diện của các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp liên quan đến axit ursonic, cũng như một loạt các dẫn xuất có hiệu lực khác nhau, họ có thể tạo ra cơ hội nhắm mục tiêu vào các cơ chế tế bào chưa biết.
Nhìn chung, việc khám phá và ứng dụng các hợp chất mới điều chỉnh động lực học vi ống sẽ cung cấp những phương pháp mạnh mẽ để giải quyết các cơ chế phân tử phức tạp làm nền tảng cho việc xác định hình dạng tế bào thực vật. Trong bối cảnh này, hợp chất axit urmotonic mới được phát triển, có tác động đến vi ống và sợi actin, đồng thời gây chết tế bào, có thể mở ra cơ hội giải mã mối liên hệ giữa sự kiểm soát vi ống và các cơ chế khác này. Do đó, phân tích hóa học và sinh học sử dụng axit urbenonic sẽ giúp chúng ta hiểu được các cơ chế điều hòa phân tử kiểm soát bộ khung tế bào thực vật.
Cấy S. werraensis MK493-CF1 vào bình Erlenmeyer có vách ngăn dung tích 500 mL chứa 110 mL môi trường hạt giống gồm 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) bột nhão Essence, 1% (w/v) chế phẩm Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) chiết xuất ngô (KOGOSTCH Co., Ltd., Nhật Bản), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 và 0,2% CaCO3 trong nước khử ion. (pH 7,4 trước khi khử trùng). Nuôi cấy hạt giống trên máy lắc quay (180 vòng/phút) ở 27°C trong 2 ngày. Nuôi cấy sản xuất thông qua quá trình lên men trạng thái rắn. Dịch nuôi cấy hạt giống (7 ml) được chuyển vào bình K-1 dung tích 500 ml chứa 40 g môi trường nuôi cấy gồm 15 g lúa mạch ép (MUSO Co., Ltd., Nhật Bản) và 25 g nước khử ion (không điều chỉnh pH trước khi khử trùng). Quá trình lên men được thực hiện ở 30°C trong bóng tối trong 14 ngày. Vật liệu lên men được chiết xuất bằng 40 ml/chai EtOH và ly tâm (1500 g, 4°C, 10 phút). Dịch nuôi cấy (60 ml) được chiết xuất bằng hỗn hợp 10% MeOH/EtOAc. Lớp hữu cơ được cô quay dưới áp suất giảm để thu được cặn (59,5 mg), sau đó tiến hành HPLC với phương pháp rửa giải theo gradient (0–10 phút: 90%) trên cột pha đảo (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × chiều dài 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 phút: 90% H2O/CH3CN đến 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 phút: 90% H2O/EtOH, 45–155 phút: 90% H2O/EtOH đến 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 phút: 100% EtOH) ở tốc độ dòng chảy 1,5 ml/phút, coumamonamide (1, 36,0 mg) được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ giá trị tính toán: 141,0659, giá trị đo được: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Hạt giống Columbia (Col-0) được lấy từ Trung tâm Tài nguyên Sinh học Arabidopsis (ABRC) với sự cho phép sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Hạt giống Col-0 được nhân giống và duy trì trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi và được sử dụng làm cây Arabidopsis hoang dã. Hạt giống Arabidopsis được khử trùng bề mặt và nuôi cấy trong môi trường Murashige và Skoog pha loãng chứa 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) axit 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) và 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ở 23 °C và ánh sáng liên tục. Hạt giống của đột biến phs1-1 được cung cấp bởi T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara).
Hạt giống của chủng SR-1 được cung cấp bởi T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara) và được sử dụng làm cây thuốc lá hoang dã. Hạt thuốc lá được khử trùng bề mặt và ngâm trong nước vô trùng trong ba đêm để thúc đẩy nảy mầm, sau đó được đặt trong dung dịch nửa nồng độ chứa 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES và 0,8% gellan gum (môi trường nuôi cấy Murashige và Skoog của Fujifilm Wako Pure Chemical) với pH 5,7 và ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Chủng Tak-1 do T. Kohchi (Đại học Kyoto) cung cấp và được sử dụng làm đơn vị thí nghiệm tiêu chuẩn cho nghiên cứu địa tiền thảo. Gemma được lấy từ cây nuôi cấy đã khử trùng, sau đó được cấy trên môi trường Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) chứa 1% sucrose và 0,3% gellan gum, rồi ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Tế bào BY-2 của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) được cung cấp bởi S. Hasezawa (Đại học Tokyo). Tế bào BY-2 được pha loãng 95 lần trong môi trường Linsmeier và Skoog đã được biến đổi và bổ sung hàng tuần bằng axit 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 . Hỗn dịch tế bào được trộn trên máy lắc quay ở tốc độ 130 vòng/phút ở 27°C trong bóng tối. Rửa tế bào bằng thể tích gấp 10 lần môi trường mới và huyền phù lại trong cùng môi trường. Các dòng tế bào chuyển gen BY-2 biểu hiện ổn định dấu hiệu vi ống TagRFP-TUA6 hoặc dấu hiệu sợi actin GFP-ABD2 dưới sự thúc đẩy của virus khảm súp lơ 35S đã được tạo ra như mô tả33,34,35. Các dòng tế bào này có thể được duy trì và đồng bộ hóa bằng các quy trình tương tự như các quy trình được sử dụng cho dòng tế bào BY-2 ban đầu.
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) bổ sung 10% huyết thanh bò, 1,2 U/ml penicillin và 1,2 μg/ml streptomycin trong tủ ấm 37°C với 5% CO2.
Tất cả các thí nghiệm được mô tả trong bản thảo này đều được thực hiện theo các quy định và hướng dẫn về an toàn sinh học của Nhật Bản.
Các hợp chất được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) dưới dạng dung dịch gốc và pha loãng trong môi trường MS đối với Arabidopsis và thuốc lá hoặc môi trường Gamborg B5 đối với địa tiền. Đối với thử nghiệm ức chế sinh trưởng rễ, hơn 10 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch có chứa các hợp chất được chỉ định hoặc DMSO. Hạt được ủ trong buồng sinh trưởng trong 7 ngày. Cây con được chụp ảnh và chiều dài của rễ được đo. Đối với thử nghiệm nảy mầm Arabidopsis, 48 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch có chứa 200 μM hợp chất hoặc DMSO. Hạt Arabidopsis được trồng trong buồng sinh trưởng và số lượng cây con nảy mầm được đếm 7 ngày sau khi nảy mầm (dag). Đối với thử nghiệm nảy mầm thuốc lá, 24 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch có chứa 200 μM KAND hoặc DMSO. Hạt thuốc lá được trồng trong buồng sinh trưởng và số lượng cây con nảy mầm được đếm sau 14 ngày. Đối với thử nghiệm ức chế sự phát triển của địa tiền, 9 phôi từ mỗi đĩa được cấy lên môi trường thạch có chứa nồng độ KAND hoặc DMSO đã chỉ định và ủ trong buồng tăng trưởng trong 14 ngày.
Sử dụng cây con nhuộm bằng propidium iodide (PI) 5 mg/ml để quan sát tổ chức mô phân sinh rễ. Tín hiệu PI được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang sử dụng kính hiển vi quét laser cộng hưởng TCS SPE (Leica Microsystems).
Nhuộm mô học rễ bằng β-glucuronidase (GUS) được thực hiện theo quy trình được mô tả bởi Malami và Benfey36. Cây con được cố định trong axeton 90% qua đêm, nhuộm bằng 0,5 mg/ml axit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic trong đệm GUS trong 1 giờ và đặt trong dung dịch cloraldehyde ngậm nước (8 g clorhydrate, 2 ml nước và 1 ml glycerol) và quan sát bằng kính hiển vi tương phản giao thoa vi sai sử dụng kính hiển vi Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Góc rễ được đo trên cây con 7 ngày tuổi trồng trên các đĩa đặt thẳng đứng. Đo góc rễ theo hướng của vectơ trọng lực như mô tả ở bước 6.
Sự sắp xếp của các vi ống vỏ não được quan sát như đã mô tả, với một số thay đổi nhỏ trong quy trình 37. Kháng thể kháng β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) và kháng thể IgG kháng chuột liên hợp Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) được sử dụng làm kháng thể sơ cấp và thứ cấp ở độ pha loãng lần lượt là 1:1000 và 1:100. Hình ảnh huỳnh quang được thu bằng kính hiển vi quét laser cộng hưởng TCS SPE (Leica Microsystems). Thu thập hình ảnh chồng Z và tạo các phép chiếu cường độ tối đa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Xét nghiệm tăng sinh tế bào HeLa được thực hiện bằng Bộ đếm tế bào 8 (Dojindo) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sự phát triển của E. coli DH5α được phân tích bằng cách đo mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ ở bước sóng 600 nm (OD600).
Tổ chức bộ khung tế bào trong tế bào BY-2 chuyển gen được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang được trang bị thiết bị quét cộng hưởng CSU-X1 (Yokogawa) và camera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Mật độ bộ khung tế bào được đánh giá bằng phân tích hình ảnh, định lượng tỷ lệ phần trăm điểm ảnh bộ khung tế bào trong số các điểm ảnh tế bào chất trong hình ảnh cộng hưởng bằng phần mềm ImageJ như đã mô tả38,39.
Để phát hiện tế bào chết trong tế bào BY-2, một phần nhỏ dịch treo tế bào được ủ với 0,05% xanh Evans trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Việc nhuộm xanh Evans chọn lọc các tế bào chết phụ thuộc vào việc đẩy thuốc nhuộm ra khỏi tế bào sống bởi màng sinh chất còn nguyên vẹn40. Các tế bào nhuộm được quan sát bằng kính hiển vi trường sáng (BX53, Olympus).
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS trong tủ ấm ẩm ở 37°C và 5% CO2. Tế bào được xử lý bằng 100 μM KAND 11, axit kumamonamic 6, kumamonamide 1, colcemid 100 ng/ml (Gibco) hoặc Nocodmaze 100 ng/ml (Sigma) trong 6 giờ ở 37°C. Tế bào được cố định bằng MetOH trong 10 phút và sau đó bằng acetate trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Tế bào cố định được ủ với kháng thể chính β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) pha loãng trong 0,5% BSA/PBS trong 2 giờ, rửa 3 lần bằng TBST, và sau đó ủ với kháng thể dê Alexa Fluor. 488 trong 1 giờ. – IgG chuột (Thermo Fisher Scientific: A11001) và 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pha loãng trong 0,5% BSA/PBS. Sau khi rửa bằng TBST ba lần, các tế bào nhuộm màu được quan sát trên kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipse Ti-E. Hình ảnh được chụp bằng camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 đã được làm lạnh bằng phần mềm MetaMorph (Thiết bị Phân tử).
Thời gian đăng: 17-06-2024