Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản trình duyệt mới hơn (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi đang hiển thị trang web mà không có kiểu dáng hoặc JavaScript.
Việc phát hiện và sử dụng có lợi các sản phẩm tự nhiên có thể giúp cải thiện cuộc sống con người. Các hóa chất ức chế sinh trưởng thực vật được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt cỏ để kiểm soát cỏ dại. Do nhu cầu sử dụng nhiều loại thuốc diệt cỏ khác nhau, nên cần phải xác định các hợp chất có cơ chế tác động mới. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất N-alkoxypyrrole mới, coumamonamide, từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và thiết lập quy trình tổng hợp hoàn chỉnh. Thông qua các thử nghiệm hoạt tính sinh học, chúng tôi phát hiện ra rằng axit urs-monoamic là chất trung gian tổng hợp của urs-monoamide và là một hợp chất tiềm năng.chất ức chế sinh trưởng thực vậtNgoài ra, chúng tôi đã phát triển nhiều dẫn xuất của axit urbenonic, bao gồm dẫn xuất urbenyloxy (UDA), có hoạt tính diệt cỏ cao mà không ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của tế bào HeLa. Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng các dẫn xuất của axit urmotonic làm gián đoạn các vi ống thực vật; thêm vào đó, KAND ảnh hưởng đến các sợi actin và gây ra hiện tượng chết tế bào; những tác dụng đa diện này khác với các chất ức chế vi ống đã biết và cho thấy một cơ chế hoạt động mới của axit ursonic, điều này thể hiện một lợi thế quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc diệt cỏ mới.
Việc khám phá và ứng dụng thực tiễn các sản phẩm tự nhiên có lợi và các dẫn xuất của chúng là một phương tiện để nâng cao chất lượng cuộc sống con người. Các chất chuyển hóa thứ cấp do vi sinh vật, thực vật và côn trùng sản sinh đã dẫn đến những tiến bộ lớn trong y học và nông nghiệp. Nhiều loại thuốc kháng sinh và thuốc chống bệnh bạch cầu đã được phát triển từ các sản phẩm tự nhiên. Ngoài ra, nhiều loại khác nhau...thuốc trừ sâuThuốc diệt nấm và thuốc diệt cỏ được chiết xuất từ các sản phẩm tự nhiên này để sử dụng trong nông nghiệp. Đặc biệt, thuốc diệt cỏ là công cụ quan trọng để tăng năng suất cây trồng trong nông nghiệp hiện đại, và nhiều loại hợp chất đã được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Một số quá trình tế bào trong thực vật, chẳng hạn như quang hợp, chuyển hóa axit amin, tổng hợp thành tế bào, điều hòa nguyên phân, tín hiệu phytohormone hoặc tổng hợp protein, được coi là mục tiêu điển hình của thuốc diệt cỏ. Các hợp chất ức chế chức năng vi ống là một nhóm thuốc diệt cỏ phổ biến ảnh hưởng đến sự phát triển của cây bằng cách tác động đến sự điều hòa nguyên phân2.
Các vi ống là thành phần của bộ khung tế bào và được bảo tồn rộng rãi trong các tế bào nhân chuẩn. Dị dimer tubulin bao gồm α-tubulin và β-tubulin tạo thành các sợi nguyên sinh vi ống tuyến tính, với 13 sợi nguyên sinh tạo thành cấu trúc hình trụ. Vi ống đóng nhiều vai trò trong tế bào thực vật, bao gồm xác định hình dạng tế bào, phân chia tế bào và vận chuyển nội bào3,4. Tế bào thực vật chứa các vi ống bên dưới màng sinh chất ở pha trung gian, và những vi ống vỏ này được cho là kiểm soát sự tổ chức của các sợi vi cellulose thông qua việc điều hòa các phức hợp cellulose synthase4,5. Các vi ống vỏ của tế bào biểu bì rễ, có mặt trong vùng kéo dài nhanh của đầu rễ, nằm ở hai bên, và các sợi vi cellulose đi theo các vi ống này và hạn chế hướng giãn nở của tế bào, do đó thúc đẩy sự kéo dài tế bào không đẳng hướng. Vì vậy, chức năng của vi ống có liên quan chặt chẽ đến hình thái thực vật. Sự thay thế axit amin trong các gen mã hóa tubulin gây ra sự lệch hướng của mảng vi ống vỏ và sự phát triển lệch trái hoặc lệch phải ở Arabidopsis 6,7. Tương tự, đột biến trong các protein liên kết với vi ống điều chỉnh động lực học của vi ống cũng có thể dẫn đến sự phát triển rễ bị biến dạng8,9,10,11,12,13. Ngoài ra, việc xử lý bằng thuốc diệt cỏ phá vỡ vi ống như disopyramide, còn được gọi là pretilachlor, cũng gây ra sự phát triển rễ xiên lệch trái14. Những dữ liệu này cho thấy rằng việc điều chỉnh chính xác chức năng của vi ống rất quan trọng để xác định hướng phát triển của cây.
Nhiều loại chất ức chế vi ống đã được phát hiện, và những loại thuốc này đã đóng góp đáng kể vào nghiên cứu về bộ khung tế bào, cũng như vào nông nghiệp và y học2. Đặc biệt, oryzalin, các hợp chất dinitroaniline, disopyramide, các hợp chất liên quan đến benzamide và các chất tương tự của chúng có thể ức chế chức năng vi ống và do đó ức chế sự phát triển của thực vật. Vì vậy, chúng được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt cỏ. Tuy nhiên, vì vi ống là một thành phần quan trọng của tế bào thực vật và động vật, hầu hết các chất ức chế vi ống đều gây độc cho cả hai loại tế bào. Do đó, mặc dù được công nhận là có ích trong việc diệt cỏ, nhưng chỉ một số lượng hạn chế các chất chống vi ống được sử dụng cho mục đích thực tiễn.
Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomyces, bao gồm các vi khuẩn hiếu khí, gram dương, dạng sợi và được biết đến rộng rãi với khả năng sản xuất nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp. Do đó, nó được coi là một trong những nguồn quan trọng nhất của các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mới. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới có tên là coumamonamide, được phân lập từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và S. werraensis ISP 5486. Bằng cách sử dụng phân tích quang phổ và phân tích quang phổ đầy đủ, cấu trúc của coumamonamide đã được xác định và khung N-alkoxypyrrole độc đáo của nó đã được xác định. Axit ursmonic, một chất trung gian tổng hợp của ursmonamide và các dẫn xuất của nó, được phát hiện có khả năng ức chế sự sinh trưởng và nảy mầm của cây Arabidopsis thaliana, một loài thực vật mô hình phổ biến. Trong một nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính, chúng tôi nhận thấy rằng một hợp chất có C9 được biến đổi thành axit ursonic, được gọi là dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (KAND), làm tăng đáng kể tác dụng ức chế sự sinh trưởng và nảy mầm. Đáng chú ý, chất ức chế sinh trưởng thực vật mới được phát hiện này cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây thuốc lá và rêu gan, và không gây độc cho vi khuẩn hoặc tế bào HeLa. Hơn nữa, một số dẫn xuất của axit urmotonic gây ra kiểu hình rễ bị biến dạng, cho thấy rằng các dẫn xuất này ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến các vi ống. Phù hợp với ý tưởng này, các quan sát của chúng tôi về các vi ống được đánh dấu bằng phương pháp miễn dịch hóa học hoặc bằng protein huỳnh quang cho thấy rằng việc xử lý bằng KAND làm phân giải các vi ống. Ngoài ra, việc xử lý bằng các dẫn xuất của axit kumamotonic làm gián đoạn các vi sợi actin. Như vậy, chúng tôi đã phát hiện ra một chất ức chế sinh trưởng thực vật mới có cơ chế hoạt động độc đáo liên quan đến việc phá hủy bộ khung tế bào.
Chủng MK493-CF1 được phân lập từ đất ở quận Shinagawa, Tokyo. Chủng MK493-CF1 tạo thành hệ sợi nấm phân nhánh tốt. Trình tự một phần của gen RNA ribosome 16S (1422 bp) đã được xác định. Chủng này rất giống với S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: chủng điển hình, 99,93%). Dựa trên kết quả này, người ta xác định rằng chủng này có quan hệ gần gũi với chủng chuẩn của S. werraensis. Do đó, chúng tôi tạm thời đặt tên cho chủng này là S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T cũng sản sinh ra các hợp chất hoạt tính sinh học tương tự. Vì trước đây có rất ít nghiên cứu về việc thu được các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật này, nên các nghiên cứu hóa học sâu hơn đã được tiến hành. Sau khi nuôi cấy S. werraensis MK493-CF1 trên môi trường lúa mạch bằng phương pháp lên men rắn ở 30°C trong 14 ngày, môi trường được chiết xuất bằng EtOH 50%. 60 ml mẫu được làm khô để thu được 59,5 mg dịch chiết thô. Dịch chiết thô được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược (reverse phase HPLC) để thu được N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, được đặt tên là coumamonamide, 36,0 mg). Tổng lượng chất 1 chiếm khoảng 60% dịch chiết thô. Do đó, chúng tôi quyết định nghiên cứu chi tiết các tính chất của kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 là một loại bột vô định hình màu trắng và phổ khối lượng độ phân giải cao (HRESIMS) xác nhận công thức C6H8N2O2 (Hình 1). Mảnh pyrrole thế C2 của hợp chất này được đặc trưng bởi δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH trong phổ 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) và δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), và phổ 13C NMR cho thấy sự hiện diện của bốn nguyên tử carbon sp2. Sự hiện diện của nhóm amide ở vị trí C2 được đánh giá bằng tương quan HMBC từ proton C-3 đến carbon carbonyl amide ở δC 161,1. Ngoài ra, các đỉnh NMR 1H và 13C ở δH 4,10 (3H, S) và δC 68,3 cho thấy sự hiện diện của nhóm N-methoxy trong phân tử. Mặc dù vị trí chính xác của nhóm methoxy vẫn chưa được xác định bằng các phương pháp phân tích quang phổ như quang phổ khác biệt tăng cường và hiệu ứng Overhauser hạt nhân (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide đã trở thành hợp chất ứng cử viên đầu tiên.
Để xác định cấu trúc chính xác của chất 1, một phản ứng tổng hợp toàn phần đã được thực hiện (Hình 2a). Xử lý 2-aminopyridine 2 có sẵn trên thị trường với m-CPBA thu được N-oxide 3 tương ứng với hiệu suất định lượng. Sau khi 2-aminoazidation của 2, phản ứng ngưng tụ vòng được mô tả bởi Abramovich đã được thực hiện trong benzen ở 90°C để thu được 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 mong muốn với khối lượng 60% (hai giai đoạn). 15,16. Sau đó, metyl hóa và thủy phân 4 thu được axit 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (được gọi là “axit cumotonic”, 6) với hiệu suất tốt (70%, hai bước). Cuối cùng, amid hóa thông qua chất trung gian clorua axit 6 bằng amoniac loãng thu được amit Kumamoto 1 với hiệu suất 98%. Tất cả dữ liệu phổ của chất 1 được tổng hợp đều tương tự như chất 1 được phân lập, do đó cấu trúc của chất 1 đã được xác định;
Tổng hợp và phân tích chung hoạt tính sinh học của urbenamide và axit urbenic. (a) Tổng hợp hoàn toàn amide Kumamoto. (b) Cây con Arabidopsis Columbia (Col) kiểu hoang dã 7 ngày tuổi được trồng trên đĩa Murashige và Skoog (MS) chứa coumamonamide 6 hoặc coumamonamide 1 ở nồng độ được chỉ định. Thanh tỷ lệ = 1 cm.
Đầu tiên, chúng tôi đánh giá hoạt tính sinh học của urbenamide và các chất trung gian của nó về khả năng điều chỉnh sự sinh trưởng của cây. Chúng tôi thêm các nồng độ khác nhau của ursmonamide 1 hoặc axit ursmonic 6 vào môi trường thạch MS và nuôi cấy cây con Arabidopsis thaliana trên môi trường này. Các thí nghiệm này cho thấy nồng độ cao (500 μM) của chất 6 ức chế sự phát triển của rễ (Hình 2b). Tiếp theo, chúng tôi tạo ra các dẫn xuất khác nhau bằng cách thay thế vị trí N1 của chất 6 và thực hiện các nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính trên chúng (quá trình tổng hợp chất tương tự được mô tả trong Thông tin bổ sung (SI)). Cây con Arabidopsis được trồng trên môi trường chứa 50 μM dẫn xuất axit ursonic, và chiều dài rễ được đo như trong hình. Như thể hiện trong Hình 3a, b và S1, các axit coumamo có độ dài chuỗi alkoxy tuyến tính khác nhau (9, 10, 11, 12 và 13) hoặc chuỗi alkoxy lớn (15, 16 và 17) ở vị trí N1. Các dẫn xuất này cho thấy sự ức chế đáng kể sự phát triển của rễ. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng việc sử dụng 200 μM 10, 11 hoặc 17 ức chế sự nảy mầm (Hình 3c và S2).
Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính của amit Kumamoto và các hợp chất liên quan. (a) Cấu trúc và sơ đồ tổng hợp các chất tương tự. (b) Định lượng chiều dài rễ của cây con 7 ngày tuổi được trồng trên môi trường MS có hoặc không có dẫn xuất coumamonamide 50 μM. Dấu sao (*) biểu thị sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng (kiểm định t, p < 0,05).< 0,05). n>18. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. nt có nghĩa là “không được kiểm tra” vì hơn 50% số hạt không nảy mầm. (c) Định lượng tỷ lệ nảy mầm của hạt được xử lý và ủ trong 7 ngày trong môi trường MS có hoặc không có 200 μM coumamonamide và các hợp chất liên quan. Dấu sao (*) biểu thị sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng (kiểm định chi bình phương). n=96.
Điều thú vị là, việc bổ sung các chuỗi nhánh alkyl dài hơn C9 làm giảm hoạt tính ức chế, cho thấy rằng các hợp chất liên quan đến axit kumamotoic cần các chuỗi nhánh có kích thước nhất định để thể hiện hoạt tính sinh học của chúng.
Vì phân tích mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính cho thấy C9 được biến đổi thành axit ursonic và dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (sau đây gọi là KAND 11) là chất ức chế sinh trưởng thực vật hiệu quả nhất, chúng tôi đã tiến hành đặc tính hóa chi tiết hơn về KAND 11. Xử lý cây Arabidopsis với 50 μM KAND 11 gần như ngăn chặn hoàn toàn sự nảy mầm, trong khi nồng độ thấp hơn (40, 30, 20 hoặc 10 μM) của KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 4a, b). Để kiểm tra xem KAND 11 có ảnh hưởng đến khả năng sống sót của mô phân sinh rễ hay không, chúng tôi đã kiểm tra mô phân sinh rễ được nhuộm bằng propidium iodide (PI) và đo kích thước vùng mô phân sinh. Kích thước của mô phân sinh của cây con được trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND-11 là 151,1 ± 32,5 μm, trong khi kích thước của mô phân sinh của cây con được trồng trên môi trường đối chứng chứa DMSO là 264,7 ± 30,8 μm (Hình 4c, d), điều này cho thấy KAND-11 phục hồi hoạt động tế bào. Sự lan rộng. Mô phân sinh rễ. Phù hợp với điều này, việc xử lý bằng KAND 11 đã làm giảm lượng tín hiệu đánh dấu phân chia tế bào CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS trong mô phân sinh rễ (Hình 4e) 17. Những kết quả này cho thấy KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ bằng cách giảm hoạt động tăng sinh tế bào.
Phân tích tác dụng ức chế của các dẫn xuất axit urbenonic (dẫn xuất urbenyloxy) đối với sự sinh trưởng. (a) Cây con Col kiểu hoang dã 7 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS với nồng độ KAND 11 được chỉ định. Thanh tỷ lệ = 1 cm. (b) Định lượng chiều dài rễ. Các chữ cái biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (kiểm định Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). n>16. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. (c) Hình ảnh hiển vi confocal của rễ cây Col kiểu hoang dã được nhuộm propidium iodide, trồng trên đĩa MS có hoặc không có 25 μM KAND 11. Dấu ngoặc trắng chỉ ra mô phân sinh rễ. Thanh tỷ lệ = 100 µm. (d) Định lượng kích thước mô phân sinh rễ (n = 10 đến 11). Sự khác biệt thống kê được xác định bằng phép thử t (p < 0,05).< 0,05). Các thanh biểu thị kích thước trung bình của mô phân sinh. (e) Kính hiển vi tương phản giao thoa vi sai (DIC) của mô phân sinh rễ chứa cấu trúc CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS được nhuộm và nhuộm trên cây con 5 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS có hoặc không có xét nghiệm KAND 25 µM.
Tính độc hại đối với thực vật của KAND 11 đã được kiểm tra thêm bằng cách sử dụng một loại cây hai lá mầm khác, cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), và một sinh vật mô hình thực vật trên cạn quan trọng, rêu gan (Marchantia polymorpha). Cũng như trường hợp của Arabidopsis, cây con thuốc lá SR-1 được trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND 11 tạo ra rễ ngắn hơn (Hình 5a). Ngoài ra, 40 trong số 48 hạt nảy mầm trên đĩa chứa 200 μM KAND 11, trong khi tất cả 48 hạt đều nảy mầm trên môi trường được xử lý giả, cho thấy nồng độ KAND cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0.05).(< 0,05; kiểm định chi bình phương) ức chế sự nảy mầm của cây thuốc lá (Hình 5b). Ngoài ra, nồng độ KAND 11 ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong rêu gan tương tự như nồng độ hiệu quả trong Arabidopsis (Hình 5c). Những kết quả này cho thấy KAND 11 có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại thực vật. Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các hợp chất liên quan đến monoamit trong các sinh vật khác, cụ thể là tế bào HeLa của người và chủng Escherichia coli DH5α, đại diện cho tế bào động vật bậc cao và tế bào vi khuẩn tương ứng. Trong một loạt các thử nghiệm tăng sinh tế bào, chúng tôi nhận thấy rằng coumamonamide 1, axit coumamonamidic 6 và KAND 11 không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào HeLa hoặc E. coli ở nồng độ 100 μM (Hình 5d,e).
Ức chế sinh trưởng của KAND 11 ở các sinh vật không phải Arabidopsis. (a) Cây con thuốc lá SR-1 kiểu hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên đĩa MS đặt thẳng đứng chứa 25 μM KAND 11. (b) Cây con thuốc lá SR-1 kiểu hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên đĩa MS đặt nằm ngang chứa 200 μM KAND 11. (c) Chồi rêu gan Tak-1 kiểu hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên đĩa Gamborg B5 với nồng độ KAND 11 được chỉ định. Mũi tên màu đỏ chỉ ra các bào tử đã ngừng phát triển trong thời gian ủ hai tuần. (d) Thí nghiệm đo sự tăng sinh tế bào HeLa. Số lượng tế bào sống được đo ở các khoảng thời gian cố định bằng bộ kit đếm tế bào 8 (Dojindo). Để đối chứng, tế bào HeLa được xử lý với 5 μg/ml actinomycin D (Act D), chất ức chế quá trình phiên mã RNA polymerase và gây chết tế bào. Phân tích được thực hiện ba lần. (e) Thí nghiệm đo sự tăng sinh tế bào E. coli. Sự phát triển của vi khuẩn E. coli được phân tích bằng cách đo OD600. Để đối chứng, các tế bào được xử lý với 50 μg/ml ampicillin (Amp), chất ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Các phân tích được thực hiện ba lần.
Để giải mã cơ chế tác động của độc tính tế bào do các hợp chất liên quan đến uramide gây ra, chúng tôi đã phân tích lại các dẫn xuất của axit urbenic có tác dụng ức chế vừa phải, như thể hiện trong hình. Như thể hiện trong Hình 2b, 6a, cây con được trồng trên đĩa thạch chứa nồng độ cao (200 μM) axit urmotonic 6 tạo ra rễ ngắn hơn và cong sang trái (θ = – 23,7 ± 6,1), trong khi cây con được trồng trên môi trường đối chứng tạo ra rễ gần như thẳng (θ = – 3,8 ± 7,1). Đặc điểm tăng trưởng xiên này được biết là do rối loạn chức năng của các vi ống vỏ não14,18. Phù hợp với phát hiện này, các loại thuốc làm mất ổn định vi ống như disopyramide và oryzalin đã gây ra hiện tượng nghiêng rễ tương tự trong điều kiện trồng trọt của chúng tôi (Hình 2b, 6a). Đồng thời, chúng tôi đã thử nghiệm các dẫn xuất của axit urmotonic và chọn ra một số dẫn xuất mà ở nồng độ nhất định, gây ra sự tăng trưởng rễ xiên. Các hợp chất 8, 9 và 15 đã làm thay đổi hướng phát triển của rễ ở nồng độ lần lượt là 75 μM, 50 μM và 40 μM, cho thấy các hợp chất này có thể làm mất ổn định vi ống một cách hiệu quả (Hình 2b, 6a). Chúng tôi cũng đã thử nghiệm dẫn xuất axit ursolic mạnh nhất, KAND 11, ở nồng độ thấp hơn (15 µM) và nhận thấy rằng việc sử dụng KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ và hướng phát triển của rễ không đồng đều, mặc dù chúng có xu hướng nghiêng về bên trái (Hình C3). Vì nồng độ cao hơn của các loại thuốc làm mất ổn định vi ống đôi khi ức chế sự phát triển của cây thay vì gây nghiêng rễ, nên sau đó chúng tôi đã đánh giá khả năng KAND 11 ảnh hưởng đến vi ống bằng cách quan sát các vi ống vỏ trong các tế bào biểu bì rễ. Phương pháp nhuộm miễn dịch sử dụng kháng thể chống β-tubulin trên các tế bào biểu bì của rễ cây con được xử lý với 25 μM KAND 11 cho thấy sự biến mất của hầu hết các vi ống vỏ trong các tế bào biểu bì ở vùng kéo dài (Hình 6b). Những kết quả này cho thấy axit kumamotonic và các dẫn xuất của nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên các vi ống để phá vỡ chúng và các hợp chất này là những chất ức chế vi ống mới.
Axit ursonic và các dẫn xuất của nó làm thay đổi vi ống vỏ rễ ở Arabidopsis thaliana. (a) Góc nghiêng của rễ được đo khi có mặt các dẫn xuất axit urmotonic khác nhau ở nồng độ được chỉ định. Tác dụng của hai hợp chất được biết là ức chế vi ống: disopyramide và oryzalin cũng được phân tích. Hình nhỏ cho thấy tiêu chuẩn được sử dụng để đo góc tăng trưởng của rễ. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng (kiểm định t, p < 0,05).< 0,05). n>19. Thang đo = 1 cm. (b) Các vi ống vỏ trong tế bào biểu bì ở vùng kéo dài. Các vi ống trong rễ Arabidopsis Col kiểu hoang dã được trồng trên đĩa MS có hoặc không có 25 μM KAND 11 được quan sát bằng phương pháp nhuộm miễn dịch sử dụng kháng thể chính β-tubulin và kháng thể phụ liên hợp Alexa Fluor. Thang đo = 10 µm. (c) Cấu trúc nguyên phân của các vi ống trong mô phân sinh rễ. Các vi ống được quan sát bằng phương pháp nhuộm miễn dịch. Các cấu trúc nguyên phân, bao gồm vùng tiền kỳ, thoi phân bào và vách ngăn tế bào, được đếm từ hình ảnh kính hiển vi confocal. Mũi tên chỉ các cấu trúc vi ống nguyên phân. Dấu hoa thị chỉ sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng (kiểm định t, p < 0,05).< 0,05). n>9. Thang đo = 50 µm.
Mặc dù Ursa có khả năng phá vỡ chức năng của vi ống, nhưng cơ chế hoạt động của nó được cho là khác với các tác nhân phân giải vi ống điển hình. Ví dụ, nồng độ cao hơn của các tác nhân phân giải vi ống như disopyramide và oryzalin gây ra sự giãn nở không đồng nhất của các tế bào biểu bì, trong khi KAND 11 thì không. Ngoài ra, việc sử dụng đồng thời KAND 11 và disopyramide dẫn đến phản ứng tăng trưởng rễ do disopyramide gây ra và sự ức chế tăng trưởng do KAND 11 gây ra (Hình S4). Chúng tôi cũng đã phân tích phản ứng của đột biến nhạy cảm quá mức với disopyramide 1-1 (phs1-1) đối với KAND 11. phs1-1 có đột biến điểm kinase tubulin không điển hình và tạo ra rễ ngắn hơn khi được xử lý bằng disopyramide9,20. Cây con đột biến phs1-1 được trồng trên môi trường thạch chứa KAND 11 có rễ ngắn hơn tương tự như những cây được trồng trên disopyramide (hình S5).
Ngoài ra, chúng tôi quan sát thấy các cấu trúc vi ống nguyên phân, chẳng hạn như vùng tiền kỳ, thoi phân bào và vách ngăn tế bào, trong mô phân sinh rễ của cây con được xử lý bằng KAND 11. Phù hợp với các quan sát đối với CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, số lượng vi ống nguyên phân giảm đáng kể (Hình 6c).
Để đặc trưng hóa độc tính tế bào của KAND 11 ở độ phân giải dưới tế bào, chúng tôi đã xử lý các tế bào nuôi cấy huyền phù thuốc lá BY-2 với KAND 11 và quan sát phản ứng của chúng. Đầu tiên, chúng tôi thêm KAND 11 vào các tế bào BY-2 biểu hiện TagRFP-TUA6, chất đánh dấu huỳnh quang các vi ống, để đánh giá tác dụng của KAND 11 lên các vi ống vỏ tế bào. Mật độ vi ống vỏ tế bào được đánh giá bằng phân tích hình ảnh, định lượng tỷ lệ phần trăm pixel khung xương tế bào trong số các pixel tế bào chất. Kết quả thí nghiệm cho thấy sau khi xử lý với 50 μM hoặc 100 μM KAND 11 trong 1 giờ, mật độ giảm đáng kể xuống còn 0,94 ± 0,74% hoặc 0,23 ± 0,28% tương ứng, trong khi mật độ của các tế bào được xử lý bằng DMSO là 1,61 ± 0,34% (Hình 7a). Những kết quả này phù hợp với quan sát ở Arabidopsis rằng việc xử lý bằng KAND 11 gây ra sự phân giải các vi ống vỏ (Hình 6b). Chúng tôi cũng đã kiểm tra dòng BY-2 với các sợi actin được gắn nhãn GFP-ABD sau khi xử lý với cùng nồng độ KAND 11 và quan sát thấy rằng việc xử lý bằng KAND 11 đã phá vỡ các sợi actin. Xử lý với 50 μM hoặc 100 μM KAND 11 trong 1 giờ đã làm giảm đáng kể mật độ sợi actin xuống còn 1,20 ± 0,62% hoặc 0,61 ± 0,26%, tương ứng, trong khi mật độ ở các tế bào được xử lý bằng DMSO là 1,69 ± 0,51% (Hình 2). 7b). Những kết quả này trái ngược với tác dụng của propyzamide, chất không ảnh hưởng đến các sợi actin, và latrunculin B, một chất phân giải actin không ảnh hưởng đến các vi ống (Hình bổ sung S6). Ngoài ra, việc điều trị bằng coumamonamide 1, coumamonamide acid 6 hoặc KAND 11 không ảnh hưởng đến vi ống trong tế bào HeLa (Hình S7 trong phần thông tin bổ sung). Do đó, cơ chế hoạt động của KAND 11 được cho là khác với cơ chế của các chất phá vỡ khung xương tế bào đã biết. Thêm vào đó, quan sát hiển vi của chúng tôi về tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 cho thấy sự bắt đầu của hiện tượng chết tế bào trong quá trình điều trị bằng KAND 11 và chỉ ra rằng tỷ lệ tế bào chết được nhuộm bằng Evans blue không tăng đáng kể sau 30 phút điều trị bằng KAND 11, trong khi sau 90 phút điều trị với 50 μM hoặc 100 μM KAND, số lượng tế bào chết tăng lên lần lượt là 43,7% hoặc 80,1% (Hình 7c). Tóm lại, những dữ liệu này cho thấy dẫn xuất axit ursolic mới KAND 11 là một chất ức chế khung xương tế bào đặc hiệu ở thực vật với cơ chế hoạt động chưa được biết đến trước đây.
KAND ảnh hưởng đến vi ống vỏ não, sợi actin và khả năng sống sót của tế bào thuốc lá BY-2. (a) Hình ảnh hiển thị vi ống vỏ não trong tế bào BY-2 khi có mặt TagRFP-TUA6. Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi confocal. Mật độ vi ống vỏ não được tính toán từ ảnh chụp của 25 tế bào độc lập. Các chữ cái biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (kiểm định Tukey HSD, p < 0.05).< 0,05). Thanh tỷ lệ = 10 µm. (b) Các sợi actin vỏ tế bào BY-2 được quan sát khi có mặt GFP-ABD2. Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi confocal. Mật độ các sợi actin vỏ tế bào được tính toán từ ảnh chụp của 25 tế bào độc lập. Các chữ cái biểu thị sự khác biệt đáng kể (kiểm định Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). Thang đo = 10 µm. (c) Quan sát các tế bào BY-2 chết bằng phương pháp nhuộm Evans blue. Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 μM hoặc 100 μM) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi trường sáng. n=3. Thang đo = 100 µm.
Việc phát hiện và ứng dụng các sản phẩm tự nhiên mới đã dẫn đến những tiến bộ đáng kể trong nhiều khía cạnh của đời sống con người, bao gồm y học và nông nghiệp. Nghiên cứu lịch sử đã được thực hiện để thu được các hợp chất hữu ích từ tài nguyên thiên nhiên. Đặc biệt, vi khuẩn Actinomycetes được biết đến là hữu ích như thuốc kháng sinh chống ký sinh trùng cho tuyến trùng nhờ khả năng sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau như avermectin, hợp chất dẫn đầu của ivermectin và bleomycin cùng các dẫn xuất của nó, được sử dụng trong y học như một chất chống ung thư21,22. Tương tự, nhiều hợp chất diệt cỏ đã được phát hiện từ vi khuẩn Actinomycetes, một số trong đó đã được sử dụng thương mại1,23. Do đó, việc phân tích các chất chuyển hóa của vi khuẩn Actinomycetes để phân lập các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mong muốn được coi là một chiến lược hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới, coumamonamide, từ S. werraensis và đã tổng hợp thành công nó. Axit ursonic là chất trung gian tổng hợp của urbenamide và các dẫn xuất của nó. Nó có thể gây ra hiện tượng xoắn rễ đặc trưng, thể hiện hoạt tính diệt cỏ từ trung bình đến mạnh và trực tiếp hoặc gián tiếp làm tổn thương các vi ống thực vật. Tuy nhiên, cơ chế tác dụng của axit urmotonic có thể khác với các chất ức chế vi ống hiện có, vì KAND 11 cũng phá vỡ các sợi actin và gây chết tế bào, cho thấy một cơ chế điều hòa mà qua đó axit urmotonic và các dẫn xuất của nó ảnh hưởng đến nhiều cấu trúc khung xương tế bào.
Việc mô tả chi tiết hơn về axit urbenonic sẽ giúp hiểu rõ hơn cơ chế hoạt động của nó. Cụ thể, mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả năng liên kết của axit ursonic với các vi ống bị khử để xác định xem axit ursonic và các dẫn xuất của nó tác động trực tiếp lên vi ống và phân giải chúng, hay tác động của chúng dẫn đến sự mất ổn định của vi ống. Ngoài ra, trong trường hợp vi ống không phải là mục tiêu trực tiếp, việc xác định vị trí tác động và các mục tiêu phân tử của axit ursonic trên tế bào thực vật sẽ giúp hiểu rõ hơn các đặc tính của các hợp chất liên quan và các cách có thể để cải thiện hoạt tính diệt cỏ. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng tôi đã tiết lộ khả năng gây độc tế bào độc đáo của axit ursonic đối với sự phát triển của các loại cây như Arabidopsis thaliana, thuốc lá và rêu gan, trong khi cả E. coli và tế bào HeLa đều không bị ảnh hưởng. Ít hoặc không gây độc cho tế bào động vật là một lợi thế của các dẫn xuất axit ursonic nếu chúng được phát triển thành thuốc diệt cỏ để sử dụng trong các cánh đồng nông nghiệp. Thật vậy, vì vi ống là cấu trúc phổ biến ở sinh vật nhân chuẩn, nên việc ức chế chọn lọc chúng ở thực vật là một yêu cầu quan trọng đối với thuốc diệt cỏ. Ví dụ, propyzamide, một chất phân giải vi ống liên kết trực tiếp với tubulin và ức chế quá trình trùng hợp, được sử dụng làm thuốc diệt cỏ do độc tính thấp đối với tế bào động vật24. Ngược lại với disopyramide, các benzamide liên quan có đặc tính mục tiêu khác nhau. Ngoài vi ống thực vật, RH-4032 hoặc benzoxamide cũng ức chế vi ống của tế bào động vật hoặc oomycetes, tương ứng, và zalilamide được sử dụng làm thuốc diệt nấm do độc tính thực vật thấp25,26,27. Bear mới được phát hiện và các dẫn xuất của nó thể hiện độc tính tế bào chọn lọc đối với thực vật, nhưng cần lưu ý rằng các sửa đổi tiếp theo có thể làm thay đổi đặc tính mục tiêu của chúng, có khả năng cung cấp thêm các dẫn xuất để kiểm soát nấm gây bệnh hoặc oomycetes.
Các đặc tính độc đáo của axit urbenonic và các dẫn xuất của nó rất hữu ích cho việc phát triển chúng thành thuốc diệt cỏ và sử dụng làm công cụ nghiên cứu. Tầm quan trọng của bộ khung tế bào trong việc kiểm soát hình dạng tế bào thực vật được công nhận rộng rãi. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng thực vật đã tiến hóa các cơ chế phức tạp về tổ chức vi ống vỏ bằng cách kiểm soát động lực học của vi ống để kiểm soát quá trình hình thái học một cách chính xác. Một số lượng lớn các phân tử chịu trách nhiệm điều chỉnh hoạt động của vi ống đã được xác định, và các nghiên cứu liên quan vẫn đang tiếp diễn3,4,28. Hiểu biết hiện tại của chúng ta về động lực học của vi ống trong tế bào thực vật không giải thích đầy đủ các cơ chế tổ chức vi ống vỏ. Ví dụ, mặc dù cả disopyramide và oryzalin đều có thể phân giải vi ống, nhưng disopyramide gây ra biến dạng rễ nghiêm trọng trong khi oryzalin có tác dụng tương đối nhẹ. Hơn nữa, đột biến ở tubulin, chất ổn định vi ống, cũng gây ra hiện tượng xoay phải ở rễ, trong khi paclitaxel, chất cũng ổn định động lực học của vi ống, lại không gây ra hiện tượng này. Do đó, việc nghiên cứu và xác định các mục tiêu phân tử của axit ursolic sẽ cung cấp những hiểu biết mới về sự điều chỉnh các vi ống vỏ thực vật. Tương tự, các so sánh trong tương lai giữa các hóa chất có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự phát triển bất thường, chẳng hạn như disopyramide, và các hóa chất kém hiệu quả hơn, chẳng hạn như oryzalin hoặc axit kumamotoric, sẽ cung cấp manh mối về cách thức xảy ra sự phát triển bất thường.
Mặt khác, sự sắp xếp lại khung xương tế bào liên quan đến cơ chế phòng vệ là một khả năng khác để giải thích độc tính của axit ursonic. Nhiễm mầm bệnh hoặc đưa chất kích thích vào tế bào thực vật đôi khi gây ra sự phá hủy khung xương tế bào và dẫn đến chết tế bào29. Ví dụ, cryptoxanthin có nguồn gốc từ nấm Oomycete được báo cáo là làm gián đoạn các vi ống và sợi actin trước khi tế bào thuốc lá chết, tương tự như những gì xảy ra với phương pháp điều trị KAND30,31. Sự tương đồng giữa các phản ứng phòng vệ và các phản ứng tế bào do axit ursonic gây ra đã khiến chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng chúng kích hoạt các quá trình tế bào chung, mặc dù tác dụng của axit ursonic nhanh hơn và mạnh hơn cryptoxanthin là điều hiển nhiên. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự gián đoạn các sợi actin thúc đẩy sự chết tế bào tự phát, điều này không phải lúc nào cũng đi kèm với sự gián đoạn vi ống29. Ngoài ra, vẫn cần phải xem xét liệu mầm bệnh hoặc chất kích thích có gây ra sự phát triển rễ bị biến dạng hay không, giống như các dẫn xuất của axit ursonic. Do đó, kiến thức phân tử liên kết các phản ứng phòng vệ và khung xương tế bào là một vấn đề hấp dẫn cần được giải quyết. Bằng cách khai thác sự hiện diện của các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp liên quan đến axit ursonic, cũng như một loạt các dẫn xuất với hiệu lực khác nhau, họ có thể tạo ra cơ hội nhắm mục tiêu vào các cơ chế tế bào chưa được biết đến.
Tóm lại, việc phát hiện và ứng dụng các hợp chất mới có khả năng điều chỉnh động lực học của vi ống sẽ cung cấp các phương pháp mạnh mẽ để giải quyết các cơ chế phân tử phức tạp chi phối việc xác định hình dạng tế bào thực vật. Trong bối cảnh này, hợp chất axit urmotonic mới được phát triển gần đây, có tác động đến vi ống và sợi actin và gây ra hiện tượng chết tế bào, có thể mang lại cơ hội để làm sáng tỏ mối liên hệ giữa sự kiểm soát vi ống và các cơ chế khác này. Do đó, phân tích hóa học và sinh học sử dụng axit urmotonic sẽ giúp chúng ta hiểu được các cơ chế điều hòa phân tử kiểm soát bộ khung tế bào thực vật.
Cấy giống S. werraensis MK493-CF1 vào bình Erlenmeyer có vách ngăn 500 mL chứa 110 mL môi trường giống gồm 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto composition. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) chiết xuất ngô (KOGOSTCH Co., Ltd., Nhật Bản), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 và 0,2% CaCO3 trong nước khử ion. (pH 7,4 trước khi tiệt trùng). Nuôi cấy giống được ủ trên máy lắc quay (180 vòng/phút) ở 27°C trong 2 ngày. Nuôi cấy sản xuất bằng phương pháp lên men rắn. Mẫu giống (7 ml) được chuyển vào bình K-1 500 ml chứa 40 g môi trường sản xuất gồm 15 g lúa mạch ép (MUSO Co., Ltd., Nhật Bản) và 25 g nước khử ion (pH không được điều chỉnh trước khi tiệt trùng). Quá trình lên men được thực hiện ở 30°C trong bóng tối trong 14 ngày. Vật liệu lên men được chiết xuất với 40 ml/chai EtOH và ly tâm (1500 g, 4°C, 10 phút). Dịch nổi (60 ml) được chiết xuất với hỗn hợp 10% MeOH/EtOAc. Lớp hữu cơ được làm bay hơi dưới áp suất giảm để thu được cặn (59,5 mg), sau đó được phân tích bằng HPLC với phương pháp rửa giải gradient (0–10 phút: 90%) trên cột pha đảo (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, đường kính trong 10 mm × chiều dài 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 phút: 90% H2O/CH3CN đến 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 phút: 90% H2O/EtOH, 45–155 phút: 90% H2O/EtOH đến 100% EtOH (gradient), 155–200 phút: 100% EtOH) với tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Coumamonamide (1, 36,0 mg) được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ giá trị tính toán: 141,0659, giá trị đo được: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Hạt giống Columbia (Col-0) được lấy từ Trung tâm Tài nguyên Sinh học Arabidopsis (ABRC) với sự cho phép sử dụng cho mục đích nghiên cứu. Hạt giống Col-0 được nhân giống và duy trì trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi và được sử dụng như cây Arabidopsis kiểu hoang dã. Hạt giống Arabidopsis được khử trùng bề mặt và nuôi cấy trong môi trường Murashige và Skoog nồng độ một nửa, chứa 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) axit 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) và 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ở 23 °C và ánh sáng liên tục. Hạt giống của đột biến phs1-1 được cung cấp bởi T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara).
Hạt giống của chủng SR-1 được cung cấp bởi T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara) và được sử dụng làm cây thuốc lá hoang dã. Hạt giống thuốc lá được khử trùng bề mặt và ngâm trong nước vô trùng trong ba đêm để thúc đẩy nảy mầm, sau đó được đặt trong dung dịch có nồng độ bằng một nửa chứa 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES và 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige và môi trường Skoog) với pH 5,7 và ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Chủng Tak-1 được cung cấp bởi T. Kohchi (Đại học Kyoto) và được sử dụng làm đơn vị thí nghiệm tiêu chuẩn cho nghiên cứu về rêu gan. Chồi non được thu thập từ cây nuôi cấy đã được khử trùng, sau đó được cấy trên môi trường Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) chứa 1% sucrose và 0,3% gellan gum và ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Tế bào thuốc lá BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) được cung cấp bởi S. Hasezawa (Đại học Tokyo). Tế bào BY-2 được pha loãng 95 lần trong môi trường Linsmeier và Skoog đã được sửa đổi và bổ sung hàng tuần bằng axit 2,4-dichlorophenoxyacetic 32. Hỗn dịch tế bào được trộn trên máy lắc quay ở tốc độ 130 vòng/phút ở 27°C trong bóng tối. Rửa tế bào với lượng môi trường mới gấp 10 lần thể tích và huyền phù lại trong cùng môi trường đó. Các dòng tế bào chuyển gen BY-2 biểu hiện ổn định dấu ấn vi ống TagRFP-TUA6 hoặc dấu ấn sợi actin GFP-ABD2 dưới sự điều khiển của promoter virus khảm súp lơ 35S đã được tạo ra như mô tả33,34,35. Các dòng tế bào này có thể được duy trì và đồng bộ hóa bằng các quy trình tương tự như các quy trình được sử dụng cho dòng tế bào BY-2 ban đầu.
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò, 1,2 U/ml penicillin và 1,2 μg/ml streptomycin trong tủ ấm 37°C với 5% CO2.
Tất cả các thí nghiệm được mô tả trong bản thảo này đều được thực hiện theo đúng các quy định và hướng dẫn về an toàn sinh học của Nhật Bản.
Các hợp chất được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) làm dung dịch gốc và pha loãng trong môi trường MS cho cây Arabidopsis và thuốc lá hoặc môi trường Gamborg B5 cho cây rêu gan. Đối với thí nghiệm ức chế sinh trưởng rễ, hơn 10 hạt mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch chứa các hợp chất đã chỉ định hoặc DMSO. Hạt được ủ trong buồng tăng trưởng trong 7 ngày. Cây con được chụp ảnh và chiều dài rễ được đo. Đối với thí nghiệm nảy mầm của Arabidopsis, 48 hạt mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch chứa 200 μM hợp chất hoặc DMSO. Hạt Arabidopsis được trồng trong buồng tăng trưởng và số lượng cây con nảy mầm được đếm sau 7 ngày nảy mầm (dag). Đối với thí nghiệm nảy mầm của thuốc lá, 24 hạt mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch chứa 200 μM KAND hoặc DMSO. Hạt thuốc lá được trồng trong buồng tăng trưởng và số lượng cây con nảy mầm được đếm sau 14 ngày. Đối với thí nghiệm ức chế sinh trưởng rêu gan, 9 phôi từ mỗi đĩa được cấy lên môi trường thạch chứa nồng độ KAND hoặc DMSO đã chỉ định và ủ trong buồng nuôi cấy trong 14 ngày.
Sử dụng cây con được nhuộm bằng propidium iodide (PI) 5 mg/ml để quan sát cấu trúc mô phân sinh rễ. Tín hiệu PI được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang sử dụng kính hiển vi quét laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Nhuộm mô học rễ bằng β-glucuronidase (GUS) được thực hiện theo quy trình được mô tả bởi Malami và Benfey36. Cây con được cố định trong acetone 90% qua đêm, nhuộm với 0,5 mg/ml axit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic trong dung dịch đệm GUS trong 1 giờ và đặt trong dung dịch chloraldehyde ngậm nước (8 g chloral hydrate, 2 ml nước và 1 ml glycerol) và quan sát bằng kính hiển vi tương phản giao thoa vi sai sử dụng kính hiển vi Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Góc rễ được đo trên cây con 7 ngày tuổi được trồng trên các đĩa đặt thẳng đứng. Đo góc của rễ so với hướng vectơ trọng lực như mô tả ở bước 6.
Sự sắp xếp của các vi ống vỏ não được quan sát như mô tả, với một số sửa đổi nhỏ đối với quy trình 37. Kháng thể chống β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) và kháng thể IgG chống chuột liên hợp Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) được sử dụng làm kháng thể chính và phụ ở nồng độ pha loãng lần lượt là 1:1000 và 1:100. Hình ảnh huỳnh quang được thu thập bằng kính hiển vi quét laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Thu thập hình ảnh Z-stack và tạo hình chiếu cường độ tối đa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Thí nghiệm xác định sự tăng sinh tế bào HeLa được thực hiện bằng cách sử dụng bộ kit đếm tế bào Cell Counting Kit 8 (Dojindo) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sự phát triển của E. coli DH5α được phân tích bằng cách đo mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ ở bước sóng 600 nm (OD600).
Cấu trúc khung xương tế bào trong tế bào BY-2 chuyển gen được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang được trang bị thiết bị quét confocal CSU-X1 (Yokogawa) và camera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Mật độ khung xương tế bào được đánh giá bằng phân tích hình ảnh, định lượng tỷ lệ phần trăm pixel khung xương tế bào trong số các pixel tế bào chất trong hình ảnh confocal bằng phần mềm ImageJ như đã mô tả38,39.
Để phát hiện sự chết tế bào trong tế bào BY-2, một phần dịch huyền phù tế bào được ủ với 0,05% Evans blue trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Việc nhuộm Evans blue chọn lọc các tế bào chết phụ thuộc vào sự đẩy thuốc nhuộm ra khỏi các tế bào sống bởi màng plasma nguyên vẹn40. Các tế bào đã được nhuộm được quan sát bằng kính hiển vi trường sáng (BX53, Olympus).
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS trong tủ ấm có độ ẩm ở 37°C và 5% CO2. Tế bào được xử lý với 100 μM KAND 11, axit kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), hoặc 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) trong 6 giờ ở 37°C. Tế bào được cố định bằng MetOH trong 10 phút và sau đó bằng acetate trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào đã cố định được ủ với kháng thể chính β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) pha loãng trong 0,5% BSA/PBS trong 2 giờ, rửa 3 lần với TBST, và sau đó ủ với kháng thể dê Alexa Fluor. 488 1 giờ. – Kháng thể IgG chuột (Thermo Fisher Scientific: A11001) và 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pha loãng trong dung dịch BSA/PBS 0,5%. Sau khi rửa ba lần bằng dung dịch TBST, các tế bào đã nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipse Ti-E. Hình ảnh được chụp bằng camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 làm mát sử dụng phần mềm MetaMorph (Molecular Devices).
Thời gian đăng bài: 17/06/2024