Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản trình duyệt mới hơn (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi đang hiển thị trang web mà không có kiểu dáng hoặc JavaScript.
Việc khám phá và sử dụng có lợi các sản phẩm tự nhiên có thể giúp cải thiện cuộc sống con người.Hóa chất ức chế tăng trưởng thực vật được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt cỏ để kiểm soát cỏ dại.Do nhu cầu sử dụng các loại thuốc diệt cỏ khác nhau nên cần phải xác định các hợp chất có cơ chế tác dụng mới.Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất N -alkoxypyrrole mới, coumamonamide, từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và thiết lập quy trình tổng hợp hoàn chỉnh.Thông qua các thử nghiệm hoạt tính sinh học, chúng tôi phát hiện ra rằng axit urs-monoamic là chất trung gian tổng hợp của urs-monoamide và có khả năngchất ức chế tăng trưởng thực vật.Ngoài ra, chúng tôi đã phát triển nhiều dẫn xuất axit urbenonic khác nhau, bao gồm dẫn xuất urbenyloxy (UDA), có hoạt tính diệt cỏ cao mà không ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của tế bào HeLa.Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng các dẫn xuất của axit urmotonic phá vỡ các vi ống thực vật;ngoài ra, KAND còn ảnh hưởng đến các sợi Actin và gây chết tế bào;Những tác dụng nhiều mặt này khác với tác dụng của các chất ức chế vi ống đã biết và gợi ý một cơ chế hoạt động mới của axit ursonic, đây là một lợi thế quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc diệt cỏ mới.
Việc khám phá và ứng dụng thực tế các sản phẩm tự nhiên có lợi và các dẫn xuất của chúng là phương tiện cải thiện chất lượng cuộc sống con người.Các chất chuyển hóa thứ cấp được tạo ra bởi vi sinh vật, thực vật và côn trùng đã mang lại những tiến bộ lớn trong y học và nông nghiệp.Nhiều loại thuốc kháng sinh và thuốc chống bệnh bạch cầu đã được phát triển từ các sản phẩm tự nhiên.Ngoài ra, các loạithuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm và thuốc diệt cỏ được chiết xuất từ các sản phẩm tự nhiên này để sử dụng trong nông nghiệp.Đặc biệt, thuốc diệt cỏ kiểm soát cỏ dại là công cụ quan trọng để tăng năng suất cây trồng trong nền nông nghiệp hiện đại và nhiều loại hợp chất khác nhau đã được sử dụng thương mại.Một số quá trình tế bào ở thực vật, chẳng hạn như quang hợp, chuyển hóa axit amin, tổng hợp thành tế bào, điều hòa nguyên phân, truyền tín hiệu phytohormone hoặc tổng hợp protein, được coi là mục tiêu điển hình của thuốc diệt cỏ.Các hợp chất ức chế chức năng vi ống là một loại thuốc diệt cỏ phổ biến ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật bằng cách ảnh hưởng đến sự điều hòa phân bào2.
Các vi ống là thành phần của bộ khung tế bào và được bảo tồn rộng rãi trong các tế bào nhân chuẩn.Các dị vòng tubulin bao gồm α-tubulin và β-tubulin tạo thành các tiền sợi vi ống tuyến tính, với 13 tiền sợi tạo thành cấu trúc hình trụ.Các vi ống đóng nhiều vai trò trong tế bào thực vật, bao gồm xác định hình dạng tế bào, phân chia tế bào và vận chuyển nội bào3,4.Tế bào thực vật chứa các vi ống bên dưới màng plasma xen kẽ, và những vi ống này được gọi là vi ống vỏ não được cho là kiểm soát việc tổ chức các vi sợi cellulose thông qua sự điều hòa của phức hợp cellulose synthase4,5.Các vi ống vỏ của tế bào biểu bì rễ, hiện diện trong vùng kéo dài nhanh của chóp rễ, nằm ở phía bên, và các vi sợi cellulose đi theo các vi ống này và hạn chế hướng mở rộng của tế bào, do đó thúc đẩy sự kéo dài tế bào dị hướng.Vì vậy, chức năng của vi ống có liên quan chặt chẽ đến hình thái thực vật.Sự thay thế axit amin trong các gen mã hóa tubulin gây ra sự lệch của các mảng vi ống vỏ não và sự phát triển về bên trái hoặc bên phải ở Arabidopsis 6,7.Tương tự, các đột biến trong các protein liên quan đến vi ống điều chỉnh động lực học của vi ống cũng có thể dẫn đến sự phát triển của rễ bị biến dạng8,9,10,11,12,13.Ngoài ra, việc xử lý bằng thuốc diệt cỏ phá vỡ vi ống như disopyramide, còn được gọi là pretilachlor, cũng gây ra sự phát triển rễ xiên bên trái14.Những dữ liệu này chỉ ra rằng việc điều chỉnh chính xác chức năng của vi ống là rất quan trọng để xác định hướng phát triển của thực vật.
Nhiều loại chất ức chế vi ống khác nhau đã được phát hiện và những loại thuốc này đã có những đóng góp đáng kể cho nghiên cứu về khung tế bào cũng như cho nông nghiệp và y học2.Đặc biệt, oryzalin, hợp chất dinitroaniline, disopyramide, các hợp chất liên quan đến benzamide và các chất tương tự của chúng có thể ức chế chức năng vi ống và do đó ức chế sự phát triển của thực vật.Vì vậy, chúng được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt cỏ.Tuy nhiên, vì vi ống là thành phần quan trọng của tế bào thực vật và động vật nên hầu hết các chất ức chế vi ống đều gây độc tế bào cho cả hai loại tế bào.Do đó, mặc dù công dụng được công nhận là thuốc diệt cỏ, một số lượng hạn chế các chất kháng vi ống được sử dụng cho các mục đích thực tế.
Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomyces, bao gồm vi khuẩn hiếu khí, gram dương, dạng sợi và được biết đến rộng rãi nhờ khả năng tạo ra nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp.Vì vậy, nó được coi là một trong những nguồn quan trọng nhất của các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mới.Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới gọi là coumamonamide, được phân lập từ Streptomyces werraensis MK493-CF1 và S. werraensis ISP 5486. Sử dụng phân tích quang phổ và phân tích quang phổ đầy đủ, cấu trúc của coumamonamide đã được mô tả và bộ xương N-alkoxypyrrole độc đáo của nó đã được xác định.tổng hợp.Axit Ursmonic, một chất trung gian tổng hợp của ursmonoamide và các dẫn xuất của nó, được phát hiện có tác dụng ức chế sự phát triển và nảy mầm của cây mô hình phổ biến Arabidopsis thaliana.Trong một nghiên cứu về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt động, chúng tôi phát hiện ra rằng một hợp chất có C9 được biến đổi thành axit ursonic, được gọi là dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (KAND), giúp tăng cường đáng kể tác dụng ức chế sự tăng trưởng và nảy mầm.Đáng chú ý, chất ức chế tăng trưởng thực vật mới được phát hiện cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của thuốc lá và rêu tản và không gây độc tế bào đối với vi khuẩn hoặc tế bào HeLa.Hơn nữa, một số dẫn xuất của axit urmotonic gây ra kiểu hình rễ bị biến dạng, ngụ ý rằng các dẫn xuất này ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến các vi ống.Phù hợp với ý tưởng này, các quan sát của chúng tôi về các vi ống được dán nhãn hóa mô miễn dịch hoặc bằng protein huỳnh quang cho thấy rằng phương pháp điều trị KAND làm mất hoạt tính của các vi ống.Ngoài ra, việc xử lý bằng các dẫn xuất của axit kumamotonic đã phá vỡ các vi sợi Actin.Vì vậy, chúng tôi đã phát hiện ra một chất ức chế tăng trưởng thực vật mới có cơ chế hoạt động độc đáo liên quan đến việc phá hủy bộ xương tế bào.
Chủng MK493-CF1 được phân lập từ đất ở Shinagawa-ku, Tokyo.Chủng MK493-CF1 hình thành sợi nấm phân nhánh tốt.Trình tự một phần của gen RNA ribosome 16S (1422 bp) đã được xác định.Chủng này rất giống với S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: chủng điển hình, 99,93%).Dựa trên kết quả này, người ta xác định chủng này có quan hệ gần gũi với chủng S. werraensis.Vì vậy, chúng tôi tạm đặt tên chủng này là S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T cũng tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự.Vì có rất ít nghiên cứu ban đầu về việc thu được các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật này nên nghiên cứu hóa học sâu hơn đã được thực hiện.Sau khi nuôi cấy S. werraensis MK493-CF1 trên môi trường lúa mạch bằng quá trình lên men ở trạng thái rắn ở 30°C trong 14 ngày, môi trường được chiết bằng 50% EtOH.60 ml mẫu được sấy khô để thu được 59,5 mg dịch chiết thô.Dịch chiết thô được xử lý bằng HPLC pha đảo để tạo ra N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, được đặt tên là coumamonamide, 36,0 mg).Tổng lượng 1 là khoảng 60% lượng chiết xuất thô.Vì vậy, chúng tôi quyết định nghiên cứu chi tiết các đặc tính của kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 là bột vô định hình màu trắng và phép đo khối phổ có độ phân giải cao (HRESIMS) xác nhận C6H8N2O2 (Hình 1).Đoạn pyrrole được thế C2 của hợp chất này có đặc điểm là δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH trong phổ 1H NMR: 4,5 Hz , H-5) và δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), và phổ 13C NMR cho thấy sự hiện diện của bốn nguyên tử carbon sp2.Sự hiện diện của nhóm amit ở vị trí C2 được đánh giá bằng mối tương quan HMBC từ proton C-3 với cacbon cacbonyl amit ở δC 161.1.Ngoài ra, các đỉnh NMR 1 H và 13 C ở δH 4.10 (3H, S) và δC 68.3 cho thấy sự hiện diện của nhóm N-methoxy trong phân tử.Mặc dù vị trí chính xác của nhóm methoxy vẫn chưa được xác định bằng cách sử dụng phân tích quang phổ như quang phổ chênh lệch nâng cao và viết tắt Overhauser hạt nhân (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide đã trở thành hợp chất ứng cử viên đầu tiên.
Để xác định cấu trúc chính xác của 1, quá trình tổng hợp tổng thể đã được thực hiện (Hình 2a).Xử lý 2-aminopyridine 2 có bán trên thị trường bằng m-CPBA mang lại hiệu suất định lượng N-oxide 3 tương ứng.Sau quá trình 2-aminoazid hóa 2, phản ứng ngưng tụ vòng do Abramovich mô tả đã được thực hiện trong benzen ở 90°C để thu được 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 tính bằng gam như mong muốn.Tốc độ 60% (hai giai đoạn).15,16.Quá trình methyl hóa và thủy phân 4 sau đó thu được axit 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (được gọi là “axit cumotonic”, 6) với hiệu suất tốt (70%, hai bước).Cuối cùng, quá trình amit hóa thông qua axit clorua trung gian 6 sử dụng dung dịch amoniac đã mang lại hiệu suất 98% cho Kumamoto amit 1.Toàn bộ số liệu phổ của 1 tổng hợp được đều giống với phổ 1 cô lập nên đã xác định được cấu trúc của 1;
Tổng hợp và phân tích chung về hoạt tính sinh học của urbenamide và axit urbenic.( a ) Tổng hợp Kumamoto amit.( b ) Cây giống Arabidopsis Columbia (Col) hoang dã 7 ngày tuổi được trồng trên các đĩa Murashige và Skoog (MS) có chứa coumamonamide 6 hoặc coumamonamide 1 ở nồng độ được chỉ định.Thanh tỷ lệ = 1 cm.
Đầu tiên, chúng tôi đánh giá các hoạt động sinh học của urbenamide và các chất trung gian của nó về khả năng điều chỉnh sự phát triển của thực vật.Chúng tôi đã bổ sung các nồng độ khác nhau của ursmonamide 1 hoặc axit ursmonic 6 vào môi trường thạch MS và cây giống Arabidopsis thaliana được nuôi cấy trên môi trường này.Những xét nghiệm này cho thấy nồng độ cao (500 μM) của 6 chất này đã ức chế sự phát triển của rễ (Hình 2b).Tiếp theo, chúng tôi tạo ra các dẫn xuất khác nhau bằng cách thay thế vị trí N1 bằng 6 và thực hiện các nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt động trên chúng (quy trình tổng hợp tương tự được mô tả trong Thông tin hỗ trợ (SI)).Cây giống Arabidopsis được trồng trên môi trường chứa dẫn xuất axit ursonic 50 μM và đo chiều dài rễ.như nó thể hiện trên hình ảnh.Như được hiển thị trong Hình 3a, b và S1, axit coumamo có độ dài khác nhau của chuỗi alkoxy tuyến tính (9, 10, 11, 12 và 13) hoặc chuỗi alkoxy lớn (15, 16 và 17) ở vị trí N1.Các dẫn xuất cho thấy sự ức chế đáng kể sự phát triển của rễ.Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng việc áp dụng 200 μM 10, 11 hoặc 17 đã ức chế sự nảy mầm (Hình 3c và S2).
Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt động của Kumamoto amit và các hợp chất liên quan.( a ) Sơ đồ cấu trúc và tổng hợp của các chất tương tự.(b) Định lượng chiều dài rễ của cây con 7 ngày tuổi trồng trên môi trường MS có hoặc không có dẫn xuất coumamonamide 50 μM.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể với điều trị giả mạo (thử nghiệm t, p< 0,05).n>18. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD.nt có nghĩa là “không được kiểm tra” vì hơn 50% hạt không nảy mầm.(c) Định lượng tỷ lệ nảy mầm của hạt đã qua xử lý ủ trong 7 ngày trong môi trường MS có hoặc không có 200 μM coumamonamide và các hợp chất liên quan.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể với phương pháp xử lý giả (kiểm tra chi bình phương).n=96.
Điều thú vị là, việc bổ sung chuỗi bên alkyl dài hơn C9 đã làm giảm hoạt động ức chế, cho thấy các hợp chất liên quan đến axit kumamotoic cần có chuỗi bên có kích thước nhất định để thể hiện hoạt động sinh học của chúng.
Bởi vì phân tích mối quan hệ cấu trúc-hoạt động cho thấy C9 đã được biến đổi thành axit ursonic và dẫn xuất nonyloxy của axit ursonic (sau đây gọi là KAND 11) là chất ức chế tăng trưởng thực vật hiệu quả nhất, chúng tôi đã tiến hành mô tả đặc tính chi tiết hơn của KAND 11. với 50 μM KAND 11 gần như ngăn chặn hoàn toàn sự nảy mầm, trong khi nồng độ thấp hơn (40, 30, 20 hoặc 10 μM) KAND 11 lại ức chế sự phát triển của rễ theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 4a, b).Để kiểm tra xem KAND 11 có ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của mô phân sinh rễ hay không, chúng tôi đã kiểm tra mô phân sinh rễ được nhuộm bằng propidium iodide (PI) và đo kích thước diện tích mô phân sinh.Kích thước mô phân sinh của cây con trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND-11 là 151,1 ± 32,5 μm, trong khi kích thước mô phân sinh của cây con trồng trên môi trường đối chứng chứa DMSO là 264,7 ± 30,8 μm (Hình 4c, d) , điều này cho thấy KAND-11 khôi phục hoạt động của tế bào.truyền bá.mô phân sinh rễ.Phù hợp với điều này, việc xử lý KAND 11 đã làm giảm lượng tín hiệu phân chia tế bào CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS trong mô phân sinh rễ (Hình 4e) 17 .Những kết quả này chỉ ra rằng KAND 11 ức chế sự phát triển của rễ bằng cách giảm hoạt động tăng sinh tế bào.
Phân tích tác dụng ức chế của dẫn xuất axit urbenonic (dẫn xuất urbenyloxy) đối với sự tăng trưởng.(a) Cây giống Col hoang dã 7 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS với nồng độ KAND 11 được chỉ định. Thanh tỷ lệ = 1 cm.( b ) Định lượng chiều dài gốc.Các chữ cái chỉ ra sự khác biệt đáng kể (Bài kiểm tra Tukey HSD, p< 0,05).n>16. Dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SD.( c ) Kính hiển vi đồng tiêu của rễ Col hoang dã nhuộm propidium iodide được trồng trên các đĩa MS có hoặc không có 25 μM KAND 11. Dấu ngoặc trắng biểu thị mô phân sinh rễ.Thanh tỷ lệ = 100 Pha.(d) Định lượng kích thước mô phân sinh rễ (n = 10 đến 11).Sự khác biệt thống kê được xác định bằng cách sử dụng t-test (p< 0,05).Các thanh đại diện cho kích thước mô phân sinh trung bình.( e ) Kính hiển vi tương phản giao thoa vi phân (DIC) của mô phân sinh gốc có chứa cấu trúc CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS được nhuộm và nhuộm màu trên cây con 5 ngày tuổi được trồng trên đĩa MS có hoặc không có xét nghiệm 25 µM KAND.
Độc tính tế bào của KAND 11 đã được thử nghiệm sâu hơn bằng cách sử dụng một loại cây hai lá mầm khác là cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và một sinh vật mô hình thực vật trên cạn chính là rêu tản (Marchantia polymorpha).Như trong trường hợp cây Arabidopsis, cây giống thuốc lá SR-1 được trồng trên môi trường chứa 25 μM KAND 11 tạo ra rễ ngắn hơn (Hình 5a).Ngoài ra, 40 trong số 48 hạt nảy mầm trên các đĩa chứa 200 μM KAND 11, trong khi tất cả 48 hạt đều nảy mầm trên môi trường được xử lý mô phỏng, cho thấy nồng độ KAND cao hơn là đáng kể (p< 0,05;chi test -square) ức chế sự nảy mầm của thuốc lá.(Hình 5b).Ngoài ra, nồng độ KAND 11 có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong rêu tản tương tự như nồng độ hiệu quả ở cây Arabidopsis (Hình 5c).Những kết quả này chỉ ra rằng KAND 11 có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại cây trồng.Sau đó, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các hợp chất liên quan đến monoamit của gấu ở các sinh vật khác, cụ thể là tế bào HeLa ở người và chủng Escherichia coli DH5α, tương ứng là đại diện của tế bào động vật và vi khuẩn bậc cao.Trong một loạt thử nghiệm tăng sinh tế bào, chúng tôi quan sát thấy coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 và KAND 11 không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào HeLa hoặc E. coli ở nồng độ 100 μM (Hình 5d, e).
Ức chế tăng trưởng KAND 11 ở các sinh vật không phải Arabidopsis.(a) Cây giống thuốc lá SR-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên đĩa MS đặt thẳng đứng chứa 25 μM KAND 11. (b) Cây giống thuốc lá SR-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên đĩa nằm ngang Các đĩa MS chứa 200 μM KAND 11. ( c) Các chồi rêu tản Tak-1 hoang dã hai tuần tuổi được trồng trên các đĩa Gamborg B5 với nồng độ KAND 11 được chỉ định. Mũi tên đỏ biểu thị các bào tử đã ngừng phát triển trong thời gian ủ hai tuần Giai đoạn.( d ) Xét nghiệm tăng sinh tế bào của tế bào HeLa.Số lượng tế bào khả thi được đo tại các khoảng thời gian cố định bằng bộ đếm tế bào 8 (Dojindo).Để kiểm soát, các tế bào HeLa được xử lý bằng 5 μg/ml Actinomycin D (Act D), chất này ức chế phiên mã RNA polymerase và gây chết tế bào.Phân tích được thực hiện trong ba lần.(e) Xét nghiệm tăng sinh tế bào E. coli.Sự phát triển của E. coli được phân tích bằng cách đo OD600.Để kiểm soát, các tế bào được xử lý bằng ampicillin (Amp) 50 μg/ml, chất này ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn.Phân tích được thực hiện trong ba lần.
Để giải mã cơ chế tác dụng gây độc tế bào do các hợp chất liên quan đến uramit gây ra, chúng tôi đã phân tích lại các dẫn xuất của axit urbenic với tác dụng ức chế vừa phải.như nó thể hiện trên hình ảnh.Như được hiển thị trong Hình 2b, 6a, cây con được trồng trên đĩa thạch chứa nồng độ cao (200 μM) axit urmotonic 6 tạo ra rễ ngắn hơn và cong sang trái (θ = – 23,7 ± 6,1), trong khi cây con được trồng trên môi trường đối chứng, cây con có rễ gần như thẳng (θ = – 3,8 ± 7,1).Sự tăng trưởng xiên đặc trưng này được biết là do rối loạn chức năng của các vi ống vỏ não14,18.Phù hợp với phát hiện này, các thuốc làm mất ổn định vi ống disopyramide và oryzalin gây ra hiện tượng nghiêng rễ tương tự trong điều kiện tăng trưởng của chúng tôi (Hình 2b, 6a).Đồng thời, chúng tôi đã thử nghiệm các dẫn xuất của axit urmotonic và chọn ra một số dẫn xuất mà ở nồng độ nhất định sẽ tạo ra sự phát triển xiên của rễ.Các hợp chất 8, 9 và 15 đã thay đổi hướng phát triển của rễ lần lượt ở mức 75 μM, 50 μM và 40 μM, cho thấy rằng các hợp chất này có thể làm mất ổn định các vi ống một cách hiệu quả (Hình 2b, 6a).Chúng tôi cũng đã thử nghiệm dẫn xuất axit ursolic mạnh nhất, KAND 11, ở nồng độ thấp hơn (15 µM) và nhận thấy rằng việc sử dụng KAND 11 đã ức chế sự phát triển của rễ và hướng phát triển của rễ không đồng đều, mặc dù chúng có xu hướng nghiêng về bên trái ( Hình C3)..Do nồng độ thuốc làm mất ổn định vi ống cao hơn đôi khi ức chế sự phát triển của thực vật hơn là gây nghiêng rễ, nên sau đó chúng tôi đã đánh giá khả năng KAND 11 ảnh hưởng đến vi ống bằng cách quan sát các vi ống vỏ não trong tế bào biểu bì rễ.Hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể kháng β-tubulin trong tế bào biểu bì của rễ cây con được xử lý bằng 25 μM KAND 11 cho thấy sự biến mất của hầu hết tất cả các vi ống vỏ não trong tế bào biểu bì ở vùng kéo dài (Hình 6b).Những kết quả này chỉ ra rằng axit kumamotonic và các dẫn xuất của nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên các vi ống để phá vỡ chúng và các hợp chất này là những chất ức chế vi ống mới.
Axit Ursonic và các dẫn xuất của nó làm thay đổi các vi ống vỏ não ở cây Arabidopsis thaliana.(a) Góc nghiêng của rễ được đo khi có sự hiện diện của các dẫn xuất axit urmotonic khác nhau ở nồng độ được chỉ định.Tác dụng của hai hợp chất được biết là có tác dụng ức chế vi ống: disopyramide và oryzalin cũng được phân tích.Hình nhỏ cho thấy tiêu chuẩn được sử dụng để đo góc phát triển của rễ.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể với điều trị giả mạo (thử nghiệm t, p< 0,05).n>19. Thanh tỷ lệ = 1 cm.(b) Các vi ống vỏ trong tế bào biểu bì ở vùng kéo dài.Các vi ống trong rễ cây Arabidopsis Col hoang dại mọc trên đĩa MS có hoặc không có 25 μM KAND 11 được hiển thị bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch bằng kháng thể chính β-tubulin và kháng thể thứ cấp liên hợp Alexa Fluor.Thanh tỷ lệ = 10 Pha.(c) Cấu trúc phân bào của vi ống trong mô phân sinh rễ.Các vi ống được hình dung bằng cách sử dụng nhuộm hóa mô miễn dịch.Các cấu trúc phân bào, bao gồm các vùng tiên tri, trục chính và thể lạp, được tính từ các hình ảnh đồng tiêu.Mũi tên chỉ cấu trúc vi ống phân bào.Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể với điều trị giả mạo (thử nghiệm t, p< 0,05).n>9. Thanh tỷ lệ = 50 µm.
Mặc dù Ursa có khả năng phá vỡ chức năng của vi ống nhưng cơ chế hoạt động của nó được cho là sẽ khác với các tác nhân khử polyme vi ống thông thường.Ví dụ, nồng độ cao hơn của các chất khử polyme vi ống như disopyramide và oryzalin gây ra sự giãn nở bất đẳng hướng của các tế bào biểu bì, trong khi KAND 11 thì không.Ngoài ra, việc sử dụng đồng thời KAND 11 và disopyramide đã dẫn đến phản ứng tăng trưởng rễ kết hợp do disopyramide gây ra và sự ức chế tăng trưởng do KAND 11 gây ra đã được quan sát thấy (Hình S4).Chúng tôi cũng đã phân tích phản ứng của đột biến disopyramide 1-1 (phs1-1) quá nhạy cảm với KAND 11. phs1-1 có đột biến điểm tubulin kinase không chính tắc và tạo ra rễ ngắn hơn khi được điều trị bằng disopyramide9,20.Cây con đột biến phs1-1 được trồng trên môi trường thạch chứa KAND 11 có rễ ngắn hơn tương tự như rễ được trồng trên disopyramid (hình S5).
Ngoài ra, chúng tôi đã quan sát thấy các cấu trúc vi ống phân bào, chẳng hạn như các vùng tiên tri, trục chính và thể lạp thể, trong mô phân sinh rễ của cây con được xử lý bằng KAND 11. Phù hợp với các quan sát đối với CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, sự giảm đáng kể về số lượng vi ống phân bào đã được quan sát (Hình .6c).
Để mô tả độc tính tế bào của KAND 11 ở độ phân giải dưới tế bào, chúng tôi đã xử lý tế bào huyền phù BY-2 của thuốc lá bằng KAND 11 và quan sát phản ứng của chúng.Trước tiên, chúng tôi đã thêm KAND 11 vào các tế bào BY-2 biểu thị TagRFP-TUA6, gắn nhãn huỳnh quang cho các vi ống, để đánh giá tác dụng của KAND 11 trên các vi ống vỏ não.Mật độ vi ống vỏ não được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích hình ảnh, định lượng tỷ lệ phần trăm các pixel tế bào trong số các pixel tế bào chất.Kết quả xét nghiệm cho thấy sau khi xử lý bằng 50 μM hoặc 100 μM KAND 11 trong 1 giờ, mật độ giảm đáng kể xuống lần lượt là 0,94 ± 0,74% hoặc 0,23 ± 0,28%, trong khi mật độ tế bào được xử lý bằng DMSO là 1,61 ± 0,34. % (Hình 7a).Những kết quả này phù hợp với quan sát ở cây Arabidopsis rằng việc xử lý KAND 11 gây ra sự khử polyme của các vi ống vỏ não (Hình 6b).Chúng tôi cũng đã kiểm tra dòng BY-2 với các sợi Actin được dán nhãn GFP-ABD sau khi xử lý với cùng nồng độ KAND 11 và quan sát thấy rằng việc xử lý KAND 11 đã phá vỡ các sợi Actin.Xử lý bằng 50 μM hoặc 100 μM KAND 11 trong 1 giờ làm giảm đáng kể mật độ sợi Actin xuống lần lượt là 1,20 ± 0,62% hoặc 0,61 ± 0,26%, trong khi mật độ trong các tế bào được xử lý DMSO là 1,69 ± 0,51% (Hình 2).7b).Những kết quả này tương phản với tác dụng của propyzamide, không ảnh hưởng đến sợi Actin và latrunculin B, một chất khử polyme Actin không ảnh hưởng đến vi ống ( SI Hình S6).Ngoài ra, điều trị bằng coumamonamide 1, axit coumamonamide 6 hoặc KAND 11 không ảnh hưởng đến các vi ống trong tế bào HeLa (SI Hình S7).Do đó, cơ chế hoạt động của KAND 11 được cho là khác với cơ chế hoạt động của các chất gây rối loạn bộ xương tế bào đã biết.Ngoài ra, quan sát bằng kính hiển vi của chúng tôi về các tế bào BY-2 được điều trị bằng KAND 11 cho thấy sự khởi đầu của tế bào chết trong quá trình điều trị KAND 11 và cho thấy tỷ lệ tế bào chết nhuộm màu xanh Evans không tăng đáng kể sau 30 phút điều trị KAND 11, trong khi sau 90 phút điều trị với 50 μM hoặc 100 μM KAND, số lượng tế bào chết tăng lên lần lượt là 43,7% hoặc 80,1% (Hình 7c).Kết hợp lại với nhau, những dữ liệu này chỉ ra rằng dẫn xuất axit ursolic mới KAND 11 là một chất ức chế khung tế bào đặc hiệu thực vật với cơ chế hoạt động chưa được biết đến trước đây.
KAND ảnh hưởng đến các vi ống vỏ não, sợi Actin và khả năng tồn tại của tế bào BY-2 thuốc lá.( a ) Hình dung các vi ống vỏ não trong tế bào BY-2 với sự hiện diện của TagRFP-TUA6.Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 M hoặc 100 M) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi đồng tiêu.Mật độ vi ống vỏ não được tính toán từ ảnh vi mô của 25 tế bào độc lập.Các chữ cái chỉ ra sự khác biệt đáng kể (Bài kiểm tra Tukey HSD, p< 0,05).Thanh tỷ lệ = 10 Pha.( b ) Các sợi Actin vỏ não trong các tế bào BY-2 được hiển thị với sự hiện diện của GFP-ABD2.Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 M hoặc 100 M) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi đồng tiêu.Mật độ của các sợi Actin vỏ não được tính toán từ ảnh vi mô của 25 tế bào độc lập.Các chữ cái chỉ ra sự khác biệt đáng kể (Bài kiểm tra Tukey HSD, p<0,05).Thanh tỷ lệ = 10 Pha.( c ) Quan sát tế bào BY-2 chết bằng phương pháp nhuộm màu xanh Evans.Các tế bào BY-2 được xử lý bằng KAND 11 (50 M hoặc 100 M) hoặc DMSO được kiểm tra bằng kính hiển vi trường sáng.n=3.Thanh tỷ lệ = 100 Pha.
Việc phát hiện và ứng dụng các sản phẩm tự nhiên mới đã dẫn đến những tiến bộ đáng kể trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống con người, bao gồm cả y học và nông nghiệp.Nghiên cứu lịch sử đã được thực hiện để thu được các hợp chất hữu ích từ tài nguyên thiên nhiên.Đặc biệt, xạ khuẩn được biết là hữu ích như kháng sinh chống ký sinh trùng cho tuyến trùng do khả năng tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau như avermectin, hợp chất chì của ivermectin và bleomycin và các dẫn xuất của nó, được sử dụng làm thuốc chống ung thư21,22.Tương tự như vậy, nhiều hợp chất diệt cỏ đã được phát hiện từ xạ khuẩn, một số trong đó đã được sử dụng thương mại1,23.Vì vậy, việc phân tích các chất chuyển hóa xạ khuẩn để phân lập các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mong muốn được coi là một chiến lược hiệu quả.Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện ra một hợp chất mới, coumamonamide, từ S. werraensis và tổng hợp thành công nó.Axit Ursonic là chất trung gian tổng hợp của urbenamide và các dẫn xuất của nó.Nó có thể gây cong rễ đặc trưng, có hoạt tính diệt cỏ từ trung bình đến mạnh và gây tổn hại trực tiếp hoặc gián tiếp đến các vi ống thực vật.Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của axit urmotonic có thể khác với cơ chế hoạt động của các chất ức chế vi ống hiện có, vì KAND 11 cũng phá vỡ các sợi Actin và gây chết tế bào, gợi ý một cơ chế điều hòa mà axit urmotonic và các dẫn xuất của nó ảnh hưởng đến một loạt các cấu trúc khung tế bào..
Đặc tính chi tiết hơn nữa của axit urbenonic sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của axit urbenonic.Đặc biệt, mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả năng axit ursonic liên kết với các vi ống bị khử để xác định xem axit ursonic và các dẫn xuất của nó có tác động trực tiếp lên các vi ống và khử polyme hóa chúng hay không, hay liệu hành động của chúng có dẫn đến mất ổn định vi ống hay không.Ngoài ra, trong trường hợp vi ống không phải là mục tiêu trực tiếp, việc xác định vị trí tác dụng và mục tiêu phân tử của axit ursonic trên tế bào thực vật sẽ giúp hiểu rõ hơn về tính chất của các hợp chất liên quan và các cách khả thi để cải thiện hoạt động diệt cỏ.Thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng tôi cho thấy khả năng gây độc tế bào độc đáo của axit ursonic đối với sự phát triển của thực vật như cây Arabidopsis thaliana, thuốc lá và cỏ gan, trong khi cả tế bào E. coli và HeLa đều không bị ảnh hưởng.Ít hoặc không có độc tính đối với tế bào động vật là một lợi thế của các dẫn xuất axit ursonic nếu chúng được phát triển làm thuốc diệt cỏ để sử dụng trên các cánh đồng nông nghiệp rộng mở.Thật vậy, vì vi ống là cấu trúc phổ biến ở sinh vật nhân chuẩn nên sự ức chế chọn lọc của chúng ở thực vật là yêu cầu then chốt đối với thuốc diệt cỏ.Ví dụ, propyzamide, một chất khử polyme vi ống liên kết trực tiếp với tubulin và ức chế quá trình trùng hợp, được sử dụng làm thuốc diệt cỏ do độc tính thấp đối với tế bào động vật24.Ngược lại với disopyramid, các benzamid liên quan có đặc tính mục tiêu khác nhau.Ngoài các vi ống thực vật, RH-4032 hoặc benzoxamide cũng lần lượt ức chế các vi ống của tế bào động vật hoặc oomycetes, và zalilamide được sử dụng làm thuốc diệt nấm do độc tính thực vật thấp25,26,27.Loài gấu mới được phát hiện và các dẫn xuất của nó thể hiện tính độc tế bào chọn lọc đối với thực vật, nhưng điều đáng chú ý là những sửa đổi tiếp theo có thể làm thay đổi tính đặc hiệu mục tiêu của chúng, có khả năng cung cấp các dẫn xuất bổ sung để kiểm soát nấm gây bệnh hoặc nấm oomycetes.
Các đặc tính độc đáo của axit urbenonic và các dẫn xuất của nó rất hữu ích cho sự phát triển của chúng dưới dạng thuốc diệt cỏ và sử dụng làm công cụ nghiên cứu.Tầm quan trọng của bộ khung tế bào trong việc kiểm soát hình dạng tế bào thực vật đã được công nhận rộng rãi.Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng thực vật đã phát triển các cơ chế phức tạp của tổ chức vi ống vỏ não bằng cách kiểm soát động lực học của vi ống để kiểm soát hình thái một cách hợp lý.Một số lượng lớn các phân tử chịu trách nhiệm điều chỉnh hoạt động của vi ống đã được xác định và nghiên cứu liên quan vẫn đang tiếp tục3,4,28.Sự hiểu biết hiện tại của chúng tôi về động lực học vi ống trong tế bào thực vật không giải thích đầy đủ các cơ chế tổ chức vi ống vỏ não.Ví dụ, mặc dù cả disopyramide và oryzalin đều có thể làm mất hoạt tính của các vi ống, nhưng disopyramide gây biến dạng rễ nghiêm trọng trong khi oryzalin có tác dụng tương đối nhẹ.Hơn nữa, các đột biến ở tubulin, giúp ổn định vi ống, cũng gây ra hiện tượng xoay ngược ở rễ, trong khi paclitaxel, cũng giúp ổn định động lực học của vi ống, thì không.Do đó, nghiên cứu và xác định các mục tiêu phân tử của axit ursolic sẽ cung cấp những hiểu biết mới về sự điều hòa các vi ống vỏ não thực vật.Tương tự như vậy, những so sánh trong tương lai về các hóa chất có hiệu quả trong việc thúc đẩy sự tăng trưởng bị bóp méo, chẳng hạn như disopyramide, và các hóa chất kém hiệu quả hơn, như oryzalin hoặc axit kumamotoric, sẽ cung cấp manh mối về việc sự tăng trưởng bị bóp méo xảy ra như thế nào.
Mặt khác, việc sắp xếp lại bộ xương tế bào liên quan đến khả năng phòng vệ là một khả năng khác để giải thích độc tính tế bào của axit ursonic.Việc lây nhiễm mầm bệnh hoặc đưa chất kích thích vào tế bào thực vật đôi khi gây ra sự phá hủy khung tế bào và sau đó làm chết tế bào29.Ví dụ, cryptoxanthin có nguồn gốc từ oomycete đã được báo cáo là có tác dụng phá vỡ các vi ống và sợi Actin trước khi tế bào thuốc lá chết, tương tự như những gì xảy ra với phương pháp điều trị KAND30,31.Sự tương đồng giữa phản ứng phòng vệ và phản ứng tế bào do axit ursonic gây ra khiến chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng chúng kích hoạt các quá trình tế bào thông thường, mặc dù rõ ràng tác dụng của axit ursonic nhanh hơn và mạnh hơn so với cryptoxanthin.Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự gián đoạn của các sợi Actin sẽ thúc đẩy quá trình chết tế bào tự phát, điều này không phải lúc nào cũng đi kèm với sự gián đoạn của vi ống29.Ngoài ra, vẫn còn phải xem liệu mầm bệnh hoặc chất kích thích có làm biến dạng sự phát triển của rễ hay không, giống như các dẫn xuất của axit ursonic đã làm.Vì vậy, kiến thức phân tử liên kết các phản ứng phòng vệ và bộ xương tế bào là một vấn đề hấp dẫn cần được giải quyết.Bằng cách khai thác sự hiện diện của các hợp chất trọng lượng phân tử thấp liên quan đến axit ursonic, cũng như một loạt các dẫn xuất có hiệu lực khác nhau, chúng có thể tạo cơ hội để nhắm mục tiêu vào các cơ chế tế bào chưa biết.
Kết hợp lại với nhau, việc phát hiện và ứng dụng các hợp chất mới điều chỉnh động lực học của vi ống sẽ cung cấp các phương pháp mạnh mẽ để giải quyết các cơ chế phân tử phức tạp làm cơ sở xác định hình dạng tế bào thực vật.Trong bối cảnh này, hợp chất axit urmotonic được phát triển gần đây, có ảnh hưởng đến vi ống và sợi Actin và gây chết tế bào, có thể tạo cơ hội giải mã mối liên hệ giữa kiểm soát vi ống và các cơ chế khác này.Vì vậy, phân tích hóa học và sinh học bằng axit urbenonic sẽ giúp chúng ta hiểu được cơ chế điều hòa phân tử kiểm soát bộ xương tế bào thực vật.
Cấy S. werraensis MK493-CF1 vào bình Erlenmeyer có vách ngăn 500 mL chứa 110 mL môi trường hạt giống gồm 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Tinh chất nhão, 1% (w/v) thành phần Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), chiết xuất ngô 0,5% (w/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., Nhật Bản), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 và 0,2% CaCO3 trong nước khử ion.(pH 7,4 trước khi khử trùng).Nuôi cấy hạt giống được ủ trên máy lắc quay (180 vòng/phút) ở 27°C trong 2 ngày.Sản xuất canh tác thông qua quá trình lên men ở trạng thái rắn.Nuôi cấy hạt giống (7 ml) được chuyển vào bình K-1 500 ml chứa 40 g môi trường sản xuất bao gồm 15 g lúa mạch ép (MUSO Co., Ltd., Nhật Bản) và 25 g nước khử ion (độ pH không được điều chỉnh). trước khi khử trùng).).Quá trình lên men được thực hiện ở 30°C trong bóng tối trong 14 ngày.Nguyên liệu lên men được chiết bằng 40 ml/chai EtOH và ly tâm (1500 g, 4°C, 10 phút).Chất nổi phía trên môi trường nuôi cấy (60 ml) được chiết bằng hỗn hợp 10% MeOH/EtOAc.Lớp hữu cơ được làm bay hơi dưới áp suất giảm để thu được cặn (59,5 mg), cặn này được xử lý bằng HPLC với rửa giải gradient (0–10 phút: 90%) trên cột pha đảo (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × chiều dài 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 phút: 90% H2O/CH3CN đến 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 phút: 90% H2O/EtOH, 45–155 phút: 90% H2O /EtOH đến 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 phút: 100% EtOH) ở tốc độ dòng 1,5 ml/phút, coumamonamide (1, 36,0 mg) được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ giá trị tính toán: 141,0659, giá trị đo được: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Hạt giống Columbia (Col-0) được lấy từ Trung tâm Tài nguyên Sinh học Arabidopsis (ABRC) với sự cho phép sử dụng trong nghiên cứu.Hạt Col-0 được nhân giống và duy trì trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi và được sử dụng làm cây Arabidopsis kiểu hoang dã.Hạt Arabidopsis được khử trùng bề mặt và nuôi cấy trong môi trường Murashige và Skoog nửa nồng độ chứa 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) axit ethanesulfonic 2-(4-morpholino) (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical ).) và thạch 1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ở 23°C và ánh sáng không đổi.Hạt giống đột biến phs1-1 được cung cấp bởi T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara).
Hạt giống chủng SR-1 do T. Hashimoto (Viện Khoa học và Công nghệ Nara) cung cấp và được sử dụng làm cây thuốc lá dại.Hạt thuốc lá được khử trùng bề mặt và ngâm trong nước vô trùng trong ba đêm để thúc đẩy sự nảy mầm, sau đó được đặt trong dung dịch nồng độ nửa chứa 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES và 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.và môi trường Skoog) có pH 5,7 và ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Chủng Tak-1 được cung cấp bởi T. Kohchi (Đại học Kyoto) và được sử dụng làm đơn vị thí nghiệm tiêu chuẩn cho nghiên cứu về rêu tản.Gemma thu được từ cây trồng đã được khử trùng và sau đó được cấy trên môi trường Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) chứa 1% sucrose và 0,3% gellan gum và ủ ở 23°C dưới ánh sáng liên tục.
Tế bào BY-2 của thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) được cung cấp bởi S. Hasezawa (Đại học Tokyo).Tế bào BY-2 được pha loãng 95 lần trong môi trường Linsmeier và Skoog đã được cải tiến và bổ sung hàng tuần axit 2,4-dichlorophenoxyacetic32.Huyền phù tế bào được trộn trên máy lắc quay ở tốc độ 130 vòng/phút ở 27°C trong bóng tối.Rửa tế bào với thể tích gấp 10 lần thể tích môi trường mới và hòa lại trong cùng môi trường.Các dòng tế bào chuyển gen BY-2 biểu hiện ổn định chất đánh dấu vi ống TagRFP-TUA6 hoặc chất đánh dấu sợi Actin GFP-ABD2 dưới chất kích thích 35S của virus khảm súp lơ đã được tạo ra như mô tả33,34,35.Những dòng tế bào này có thể được duy trì và đồng bộ hóa bằng cách sử dụng các quy trình tương tự như các quy trình được sử dụng cho dòng tế bào BY-2 ban đầu.
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong môi trường Eagle's cải tiến (DMEM) (Life Technologies) của Dulbecco được bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai, penicillin 1,2 U/ml và streptomycin 1,2 μg/ml trong tủ ấm 37°C với 5% CO2.
Tất cả các thí nghiệm được mô tả trong bản thảo này được thực hiện theo các quy định và hướng dẫn về an toàn sinh học của Nhật Bản.
Các hợp chất được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) dưới dạng dung dịch gốc và pha loãng trong môi trường MS đối với cây Arabidopsis và thuốc lá hoặc môi trường Gamborg B5 cho gan.Đối với thử nghiệm ức chế sự phát triển của rễ, hơn 10 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch có chứa các hợp chất được chỉ định hoặc DMSO.Hạt giống được ủ trong buồng tăng trưởng trong 7 ngày.Cây con được chụp ảnh và đo chiều dài của rễ.Đối với xét nghiệm nảy mầm của cây Arabidopsis, 48 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch chứa hợp chất 200 μM hoặc DMSO.Hạt Arabidopsis được ươm trong buồng tăng trưởng và số lượng cây con nảy mầm được đếm 7 ngày sau khi nảy mầm (dag).Đối với xét nghiệm nảy mầm của thuốc lá, 24 hạt trên mỗi đĩa được gieo trên môi trường thạch chứa 200 μM KAND hoặc DMSO.Hạt thuốc lá được trồng trong buồng tăng trưởng và số cây con nảy mầm được đếm sau 14 ngày.Đối với xét nghiệm ức chế tăng trưởng rêu tản, 9 phôi từ mỗi đĩa được đặt trên môi trường thạch chứa nồng độ KAND hoặc DMSO được chỉ định và ủ trong buồng tăng trưởng trong 14 ngày.
Sử dụng cây con được nhuộm bằng 5 mg/ml propidium iodide (PI) để hình dung tổ chức mô phân sinh rễ.Tín hiệu PI được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang sử dụng kính hiển vi quét laser đồng tiêu TCS SPE (Leica Microsystems).
Nhuộm mô hóa rễ bằng β-glucuronidase (GUS) được thực hiện theo quy trình được mô tả bởi Malami và Benfey36.Cây con được cố định trong axeton 90% qua đêm, nhuộm bằng axit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic 0,5 mg/ml trong dung dịch đệm GUS trong 1 giờ và đặt vào dung dịch chloraldehyde ngậm nước.(8 g chloral hydrat, 2 ml nước và 1 ml glycerol) và quan sát bằng kính hiển vi tương phản giao thoa vi phân sử dụng kính hiển vi Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Góc rễ được đo trên cây con 7 ngày tuổi trồng trên đĩa đặt thẳng đứng.Đo góc của gốc theo hướng của vectơ trọng lực như mô tả ở bước 6.
Sự sắp xếp của các vi ống vỏ não được quan sát như mô tả, với những sửa đổi nhỏ đối với quy trình 37.Kháng thể kháng β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) và IgG kháng chuột liên hợp Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) được sử dụng làm kháng thể sơ cấp và thứ cấp ở độ pha loãng 1:1000 và 1:100, tương ứng.Hình ảnh huỳnh quang được thu được bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu TCS SPE (Leica Microsystems).Thu thập hình ảnh Z-stack và tạo các phép chiếu cường độ tối đa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Xét nghiệm tăng sinh tế bào HeLa được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ đếm tế bào 8 (Dojindo) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sự phát triển của E. coli DH5α được phân tích bằng cách đo mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm (OD600).
Tổ chức bộ xương tế bào trong các tế bào BY-2 biến đổi gen được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang được trang bị thiết bị quét đồng tiêu CSU-X1 (Yokogawa) và máy ảnh sCMOS (Zyla, Andor Technology).Mật độ khung tế bào được đánh giá bằng phân tích hình ảnh, định lượng tỷ lệ phần trăm pixel tế bào giữa các pixel tế bào chất trong hình ảnh đồng tiêu bằng phần mềm ImageJ như mô tả38,39.
Để phát hiện tế bào chết trong tế bào BY-2, một phần huyền phù tế bào được ủ với xanh Evans 0,05% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.Việc nhuộm màu xanh Evans có chọn lọc của các tế bào chết phụ thuộc vào việc đùn thuốc nhuộm từ các tế bào sống bằng màng sinh chất còn nguyên vẹn40.Các tế bào nhuộm màu được quan sát bằng kính hiển vi trường sáng (BX53, Olympus).
Tế bào HeLa được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS trong tủ ấm tạo ẩm ở 37°C và 5% CO2.Các tế bào được xử lý bằng 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) hoặc 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) trong 6 giờ ở 37°C.Các tế bào được cố định bằng MetOH trong 10 phút và sau đó bằng axetat trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.Các tế bào cố định được ủ bằng kháng thể chính β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) được pha loãng trong 0,5% BSA/PBS trong 2 giờ, rửa 3 lần bằng TBST và sau đó được ủ bằng kháng thể dê Alexa Fluor.488 1 giờ.– Chuột IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) và 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pha loãng trong 0,5% BSA/PBS.Sau khi rửa bằng TBST ba lần, các tế bào nhuộm màu được quan sát trên kính hiển vi đảo ngược Ti-E của Nikon Eclipse.Hình ảnh được chụp bằng camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 được làm mát bằng phần mềm MetaMorph (Thiết bị phân tử).
Thời gian đăng: 17-06-2024