Giun tròn thông là một loại ký sinh trùng nội bào di cư thuộc diện kiểm dịch, được biết đến là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng trong hệ sinh thái rừng thông. Nghiên cứu này xem xét hoạt tính diệt giun tròn của các indole halogen hóa đối với giun tròn thông và cơ chế hoạt động của chúng. Hoạt tính diệt giun tròn của 5-iodoindole và avermectin (chất đối chứng dương) đối với giun tròn thông tương tự nhau và cao ở nồng độ thấp (10 μg/mL). 5-iodoindole làm giảm khả năng sinh sản, hoạt động sinh sản, tỷ lệ tử vong của phôi và ấu trùng, và hành vi vận động. Tương tác phân tử của các phối tử với các thụ thể kênh clorua cổng glutamate đặc hiệu ở động vật không xương sống hỗ trợ quan điểm rằng 5-iodoindole, giống như avermectin, liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động của thụ thể. 5-Iodoindole cũng gây ra nhiều biến dạng kiểu hình khác nhau ở giun tròn, bao gồm sự sụp đổ/co rút bất thường của các cơ quan và tăng sự hình thành không bào. Những kết quả này cho thấy rằng không bào có thể đóng vai trò trong cái chết do methyl hóa ở giun tròn. Điều quan trọng là, 5-iodoindole không độc hại đối với cả hai loài thực vật (bắp cải và củ cải). Do đó, nghiên cứu này chứng minh rằng việc sử dụng iodoindole trong điều kiện môi trường có thể kiểm soát được tổn thương do bệnh héo rũ thông gây ra.
Giun tròn gỗ thông (Bursaphelenchus xylophilus) thuộc nhóm giun tròn gỗ thông (PWN), là loài giun tròn nội ký sinh di cư gây ra thiệt hại sinh thái nghiêm trọng cho hệ sinh thái rừng thông1. Bệnh héo thông (PWD) do giun tròn gỗ thông gây ra đang trở thành vấn đề nghiêm trọng ở nhiều châu lục, bao gồm châu Á và châu Âu, và ở Bắc Mỹ, giun tròn này phá hủy các loài thông du nhập1,2. Suy giảm cây thông là một vấn đề kinh tế lớn, và triển vọng lây lan toàn cầu của nó rất đáng lo ngại3. Các loài thông thường bị giun tròn tấn công nhất bao gồm: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii và Pinus radiata4. Giun tròn thông là một bệnh nghiêm trọng có thể giết chết cây thông trong vòng vài tuần hoặc vài tháng sau khi nhiễm bệnh. Ngoài ra, sự bùng phát của giun tròn thông thường xảy ra ở nhiều hệ sinh thái khác nhau, do đó các chuỗi lây nhiễm dai dẳng đã được thiết lập1.
Bursaphelenchus xylophilus là một loại giun tròn ký sinh thực vật thuộc diện kiểm dịch, thuộc siêu họ Aphelenchoidea và nhánh 102.5. Giun tròn này ăn nấm và sinh sản trong mô gỗ của cây thông, phát triển qua bốn giai đoạn ấu trùng khác nhau: L1, L2, L3, L4 và cá thể trưởng thành1,6. Trong điều kiện thiếu thức ăn, giun tròn thông chuyển sang giai đoạn ấu trùng chuyên biệt – giai đoạn ngủ đông (dauer), ký sinh trên vật chủ trung gian – bọ cánh cứng vỏ thông (Monochamus alternatus) và được truyền sang cây thông khỏe mạnh. Ở vật chủ khỏe mạnh, giun tròn nhanh chóng di chuyển qua các mô thực vật và ăn các tế bào nhu mô, dẫn đến một số phản ứng quá mẫn, héo rũ và chết cây thông trong vòng một năm sau khi nhiễm bệnh1,7,8.
Kiểm soát sinh học tuyến trùng thông từ lâu đã là một thách thức, với các biện pháp kiểm dịch có từ thế kỷ 20. Các chiến lược hiện tại để kiểm soát tuyến trùng thông chủ yếu liên quan đến xử lý hóa học, bao gồm hun khói gỗ và cấy thuốc diệt tuyến trùng vào thân cây. Các loại thuốc diệt tuyến trùng được sử dụng phổ biến nhất là avermectin và avermectin benzoate, thuộc họ avermectin. Những hóa chất đắt tiền này rất hiệu quả chống lại nhiều loài tuyến trùng và được coi là an toàn với môi trường9. Tuy nhiên, việc sử dụng lặp đi lặp lại các loại thuốc diệt tuyến trùng này được cho là sẽ tạo ra áp lực chọn lọc, gần như chắc chắn sẽ dẫn đến sự xuất hiện của tuyến trùng thông kháng thuốc, như đã được chứng minh đối với một số loài côn trùng gây hại, chẳng hạn như Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella và các loài tuyến trùng Trichostrongylus colubriformis và Ostertagia circumcincta, đã dần phát triển khả năng kháng avermectin10,11,12. Do đó, cần phải thường xuyên nghiên cứu các kiểu kháng thuốc và liên tục sàng lọc các loại thuốc diệt tuyến trùng để tìm ra các biện pháp thay thế, tiết kiệm chi phí và thân thiện với môi trường để kiểm soát bệnh PVD. Trong những thập kỷ gần đây, một số tác giả đã đề xuất sử dụng chiết xuất thực vật, tinh dầu và các chất dễ bay hơi làm tác nhân kiểm soát tuyến trùng13,14,15,16.
Gần đây, chúng tôi đã chứng minh hoạt tính diệt tuyến trùng của indole, một phân tử tín hiệu giữa các tế bào và giữa các giới sinh vật, ở Caenorhabditis elegans 17. Indole là một tín hiệu nội bào phổ biến trong sinh thái học vi sinh vật, kiểm soát nhiều chức năng ảnh hưởng đến sinh lý vi sinh vật, sự hình thành bào tử, tính ổn định của plasmid, khả năng kháng thuốc, sự hình thành màng sinh học và độc lực 18, 19. Hoạt tính của indole và các dẫn xuất của nó đối với các loài tuyến trùng gây bệnh khác chưa được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã điều tra hoạt tính diệt tuyến trùng của 34 indole đối với tuyến trùng thông và làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của 5-iodoindole mạnh nhất bằng cách sử dụng kính hiển vi, chụp ảnh tua nhanh thời gian và các thí nghiệm ghép nối phân tử, đồng thời đánh giá tác động độc hại của nó đối với thực vật bằng cách sử dụng thử nghiệm nảy mầm hạt giống.
Nồng độ cao (>1,0 mM) của indole đã được báo cáo trước đây là có tác dụng diệt tuyến trùng17. Sau khi xử lý B. xylophilus (các giai đoạn sống khác nhau) bằng indole hoặc 33 dẫn xuất indole khác nhau ở nồng độ 1 mM, tỷ lệ tử vong của B. xylophilus được đo bằng cách đếm số tuyến trùng sống và chết trong nhóm đối chứng và nhóm được xử lý. Năm loại indole cho thấy hoạt tính diệt tuyến trùng đáng kể; tỷ lệ sống sót của nhóm đối chứng không được xử lý là 95 ± 7% sau 24 giờ. Trong số 34 loại indole được thử nghiệm, 5-iodoindole và 4-fluoroindole ở nồng độ 1 mM gây ra tỷ lệ tử vong 100%, trong khi 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate và 7-iodoindole gây ra tỷ lệ tử vong khoảng 50% (Bảng 1).
Ảnh hưởng của 5-iodoindole đến sự hình thành không bào và quá trình trao đổi chất của tuyến trùng gỗ thông. (A) Ảnh hưởng của avermectin và 5-iodoindole lên tuyến trùng đực trưởng thành, (B) trứng tuyến trùng giai đoạn L1 và (C) quá trình trao đổi chất của B. xylophilus, (i) không quan sát thấy không bào ở thời điểm 0 giờ, quá trình xử lý dẫn đến (ii) sự hình thành không bào, (iii) sự tích tụ nhiều không bào, (iv) sự phồng lên của không bào, (v) sự hợp nhất của không bào và (vi) sự hình thành các không bào khổng lồ. Mũi tên màu đỏ chỉ sự phồng lên của không bào, mũi tên màu xanh chỉ sự hợp nhất của không bào và mũi tên màu đen chỉ các không bào khổng lồ. Thanh tỷ lệ = 50 μm.
Ngoài ra, nghiên cứu này cũng mô tả quá trình chết tế bào do khí metan gây ra ở giun tròn thông (Hình 4C). Chết do sinh khí metan là một loại chết tế bào không do apoptosis, liên quan đến sự tích tụ các không bào tế bào chất nổi bật27. Các khiếm khuyết hình thái quan sát được ở giun tròn thông dường như có liên quan chặt chẽ đến cơ chế chết do khí metan gây ra. Kiểm tra hiển vi ở các thời điểm khác nhau cho thấy các không bào khổng lồ được hình thành sau 20 giờ tiếp xúc với 5-iodoindole (0,1 mM). Các không bào nhỏ được quan sát thấy sau 8 giờ điều trị, và số lượng của chúng tăng lên sau 12 giờ. Một số không bào lớn được quan sát thấy sau 14 giờ. Một số không bào hợp nhất có thể nhìn thấy rõ ràng sau 12-16 giờ điều trị, cho thấy sự hợp nhất không bào là cơ sở của cơ chế chết do sinh khí metan. Sau 20 giờ, một số không bào khổng lồ được tìm thấy khắp cơ thể giun. Những quan sát này đại diện cho báo cáo đầu tiên về hiện tượng metuosis ở C. elegans.
Ở những con giun được xử lý bằng 5-iodoindole, hiện tượng tập hợp và vỡ không bào cũng được quan sát thấy (Hình 5), được thể hiện bằng việc giun uốn cong và không bào được giải phóng vào môi trường. Sự phá vỡ không bào cũng được quan sát thấy ở màng vỏ trứng, vốn thường được giữ nguyên vẹn bởi ấu trùng L2 trong quá trình nở (Hình bổ sung S2). Những quan sát này ủng hộ sự tham gia của hiện tượng tích tụ dịch và suy giảm điều hòa thẩm thấu, cũng như tổn thương tế bào có thể hồi phục (RCI), trong quá trình hình thành không bào và mưng mủ (Hình 5).
Dựa trên giả thuyết về vai trò của iốt trong sự hình thành không bào quan sát được, chúng tôi đã nghiên cứu hoạt tính diệt tuyến trùng của natri iodua (NaI) và kali iodua (KI). Tuy nhiên, ở các nồng độ (0,1, 0,5 hoặc 1 mM), chúng không ảnh hưởng đến sự sống sót của tuyến trùng hoặc sự hình thành không bào (Hình bổ sung S5), mặc dù 1 mM KI có tác dụng diệt tuyến trùng nhẹ. Mặt khác, 7-iodoindole (1 hoặc 2 mM), giống như 5-iodoindole, gây ra nhiều không bào và biến dạng cấu trúc (Hình bổ sung S6). Hai iodoindole cho thấy các đặc điểm kiểu hình tương tự ở tuyến trùng thông, trong khi NaI và KI thì không. Điều thú vị là, indole không gây ra sự hình thành không bào ở B. xylophilus ở các nồng độ đã thử nghiệm (dữ liệu không được hiển thị). Do đó, kết quả đã xác nhận rằng phức hợp indole-iốt chịu trách nhiệm cho quá trình tạo không bào và chuyển hóa của B. xylophilus.
Trong số các indole được thử nghiệm về hoạt tính diệt tuyến trùng, 5-iodoindole có chỉ số trượt cao nhất là -5,89 kcal/mol, tiếp theo là 7-iodoindole (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindole (-4,33) và indole (-4,03) (Hình 6). Liên kết hydro mạnh của chuỗi chính 5-iodoindole với leucine 218 giúp ổn định sự liên kết của nó, trong khi tất cả các dẫn xuất indole khác liên kết với serine 260 thông qua liên kết hydro ở chuỗi bên. Trong số các iodoindole được mô hình hóa khác, 2-iodoindole có giá trị liên kết là -5,248 kcal/mol, do liên kết hydro chính của nó với leucine 218. Các liên kết đã biết khác bao gồm 3-iodoindole (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4,0 kcal/mol) và 6-fluoroindole (-2,6 kcal/mol) (Hình bổ sung S8). Hầu hết các indole halogen hóa và bản thân indole, ngoại trừ 5-iodoindole và 2-iodoindole, đều tạo liên kết với serine 260. Thực tế là liên kết hydro với leucine 218 cho thấy sự liên kết hiệu quả giữa thụ thể và phối tử, như đã quan sát thấy đối với ivermectin (Hình bổ sung S7), xác nhận rằng 5-iodoindole và 2-iodoindole, giống như ivermectin, liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động của thụ thể GluCL thông qua leucine 218 (Hình 6 và Hình bổ sung S8). Chúng tôi đề xuất rằng sự liên kết này là cần thiết để duy trì cấu trúc lỗ mở của phức hợp GluCL và bằng cách liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động của thụ thể GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin và ivermectin do đó duy trì kênh ion mở và cho phép hấp thụ chất lỏng.
Mô phỏng liên kết phân tử của indole và indole halogen hóa với GluCL. Định hướng liên kết của các phối tử (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole và (D) 5-iodoindole với vị trí hoạt động của GluCL. Protein được biểu diễn bằng một dải ruy băng, và các liên kết hydro trên khung xương được thể hiện bằng các đường chấm vàng. (A′), (B′), (C′) và (D′) cho thấy sự tương tác của các phối tử tương ứng với các gốc axit amin xung quanh, và các liên kết hydro ở chuỗi bên được chỉ ra bằng các mũi tên chấm hồng.
Các thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá tác động độc hại của 5-iodoindole đối với sự nảy mầm của hạt bắp cải và củ cải. 5-iodoindole (0,05 hoặc 0,1 mM) hoặc avermectin (10 μg/mL) có rất ít hoặc không ảnh hưởng đến sự nảy mầm ban đầu và sự xuất hiện của cây con (Hình 7). Ngoài ra, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy giữa tỷ lệ nảy mầm của nhóm đối chứng không được xử lý và nhóm hạt được xử lý bằng 5-iodoindole hoặc avermectin. Tác động đến sự kéo dài rễ chính và số lượng rễ phụ hình thành là không đáng kể, mặc dù 1 mM (gấp 10 lần nồng độ hoạt tính của nó) của 5-iodoindole làm chậm nhẹ sự phát triển của rễ phụ. Những kết quả này cho thấy 5-iodoindole không độc hại đối với tế bào thực vật và không gây cản trở đến các quá trình phát triển của cây ở các nồng độ đã nghiên cứu.
Ảnh hưởng của 5-iodoindole đến sự nảy mầm của hạt. Sự nảy mầm, mọc chồi và hình thành rễ bên của hạt B. oleracea và R. raphanistrum trên môi trường thạch Murashige và Skoog có hoặc không có avermectin hoặc 5-iodoindole. Tỷ lệ nảy mầm được ghi nhận sau 3 ngày ủ ở 22°C.
Nghiên cứu này báo cáo một số trường hợp tiêu diệt tuyến trùng bằng indole. Quan trọng hơn, đây là báo cáo đầu tiên về việc iodoindole gây ra quá trình methyl hóa (một quá trình do sự tích tụ các không bào nhỏ dần dần hợp nhất thành các không bào khổng lồ, cuối cùng dẫn đến vỡ màng và chết) ở lá thông, với iodoindole thể hiện các đặc tính diệt tuyến trùng đáng kể tương tự như thuốc diệt tuyến trùng thương mại avermectin.
Các indole trước đây đã được báo cáo là có nhiều chức năng truyền tín hiệu ở sinh vật nhân sơ và nhân thực, bao gồm ức chế/hình thành màng sinh học, sự sống sót của vi khuẩn và khả năng gây bệnh19,32,33,34. Gần đây, tác dụng điều trị tiềm năng của các indole halogen hóa, ancaloit indole và các dẫn xuất indole bán tổng hợp đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu rộng rãi35,36,37. Ví dụ, các indole halogen hóa đã được chứng minh là có khả năng tiêu diệt các tế bào Escherichia coli và Staphylococcus aureus dai dẳng37. Ngoài ra, việc nghiên cứu hiệu quả của các indole halogen hóa đối với các loài, chi và giới khác cũng rất đáng quan tâm về mặt khoa học, và nghiên cứu này là một bước tiến hướng tới mục tiêu đó.
Ở đây, chúng tôi đề xuất một cơ chế gây chết do 5-iodoindole ở C. elegans dựa trên tổn thương tế bào có thể đảo ngược (RCI) và quá trình methyl hóa (Hình 4C và 5). Những thay đổi phù nề như sưng phồng và thoái hóa không bào là dấu hiệu của RCI và quá trình methyl hóa, biểu hiện dưới dạng các không bào khổng lồ trong tế bào chất48,49. RCI can thiệp vào quá trình sản xuất năng lượng bằng cách giảm sản xuất ATP, gây ra sự hỏng hóc của bơm ATPase, hoặc phá vỡ màng tế bào và gây ra sự xâm nhập nhanh chóng của Na+, Ca2+ và nước50,51,52. Các không bào nội bào chất phát sinh trong tế bào động vật do sự tích tụ chất lỏng trong tế bào chất do sự xâm nhập của Ca2+ và nước53. Điều thú vị là, cơ chế gây tổn thương tế bào này có thể đảo ngược nếu tổn thương chỉ là tạm thời và các tế bào bắt đầu sản xuất ATP trong một khoảng thời gian nhất định, nhưng nếu tổn thương kéo dài hoặc trở nên nghiêm trọng hơn, các tế bào sẽ chết.54 Quan sát của chúng tôi cho thấy giun tròn được xử lý bằng 5-iodoindole không thể khôi phục quá trình sinh tổng hợp bình thường sau khi tiếp xúc với điều kiện căng thẳng.
Hiện tượng methyl hóa do 5-iodoindole gây ra ở B. xylophilus có thể là do sự hiện diện của iốt và sự phân bố phân tử của nó, vì 7-iodoindole có tác dụng ức chế B. xylophilus ít hơn 5-iodoindole (Bảng 1 và Hình bổ sung S6). Những kết quả này phần nào phù hợp với các nghiên cứu của Maltese et al. (2014), người đã báo cáo rằng sự dịch chuyển của nhóm nitơ pyridyl trong indole từ vị trí para sang vị trí meta đã loại bỏ sự hình thành không bào, ức chế tăng trưởng và độc tính tế bào ở tế bào U251, cho thấy sự tương tác của phân tử với một vị trí hoạt động cụ thể trong protein là rất quan trọng27,44,45. Sự tương tác giữa indole hoặc indole halogen hóa và thụ thể GluCL được quan sát trong nghiên cứu này cũng ủng hộ quan điểm này, vì 5- và 2-iodoindole được tìm thấy liên kết với thụ thể GluCL mạnh hơn các indole khác được kiểm tra (Hình 6 và Hình bổ sung S8). Iốt ở vị trí thứ hai hoặc thứ năm của indole được phát hiện liên kết với leucine 218 của thụ thể GluCL thông qua liên kết hydro mạch chính, trong khi các indole halogen hóa khác và bản thân indole tạo thành các liên kết hydro mạch nhánh yếu với serine 260 (Hình 6). Do đó, chúng tôi suy đoán rằng vị trí của halogen đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra thoái hóa không bào, trong khi sự liên kết chặt chẽ của 5-iodoindole giữ cho kênh ion mở, cho phép dòng chảy dịch nhanh chóng và vỡ không bào. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động chi tiết của 5-iodoindole vẫn cần được xác định.
Trước khi ứng dụng thực tiễn 5-iodoindole, cần phân tích tác động độc hại của nó đối với thực vật. Thí nghiệm nảy mầm hạt giống của chúng tôi cho thấy 5-iodoindole không có tác động tiêu cực đến quá trình nảy mầm hạt giống hoặc các quá trình phát triển tiếp theo ở nồng độ đã nghiên cứu (Hình 7). Do đó, nghiên cứu này cung cấp cơ sở cho việc sử dụng 5-iodoindole trong môi trường sinh thái để kiểm soát tác hại của tuyến trùng thông đối với cây thông.
Các báo cáo trước đây đã chứng minh rằng liệu pháp dựa trên indole là một phương pháp tiềm năng để giải quyết vấn đề kháng kháng sinh và sự tiến triển của ung thư55. Ngoài ra, indole có hoạt tính kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, chống tiểu đường, chống virus, chống tăng sinh và chống lao, và có thể là cơ sở đầy hứa hẹn cho việc phát triển thuốc56,57. Nghiên cứu này lần đầu tiên đề xuất khả năng sử dụng iốt như một chất chống ký sinh trùng và chống giun sán.
Avermectin được phát hiện cách đây ba thập kỷ và đã đoạt giải Nobel năm 2015, và việc sử dụng nó như một loại thuốc trị giun sán vẫn đang được tiến hành tích cực. Tuy nhiên, do sự phát triển nhanh chóng của tình trạng kháng thuốc avermectin ở tuyến trùng và côn trùng gây hại, cần có một chiến lược thay thế, chi phí thấp và thân thiện với môi trường để kiểm soát nhiễm tuyến trùng gây hại cây thông. Nghiên cứu này cũng báo cáo cơ chế mà 5-iodoindole tiêu diệt tuyến trùng gây hại cây thông và cho thấy 5-iodoindole có độc tính thấp đối với tế bào thực vật, mở ra triển vọng tốt cho ứng dụng thương mại trong tương lai.
Tất cả các thí nghiệm đều được Ủy ban Đạo đức của Đại học Yeungnam, Gyeongsan, Hàn Quốc phê duyệt và các phương pháp được thực hiện theo đúng hướng dẫn của Ủy ban Đạo đức Đại học Yeungnam.
Các thí nghiệm ấp trứng được thực hiện bằng các quy trình đã được thiết lập43. Để đánh giá tỷ lệ nở (HR), giun tròn trưởng thành 1 ngày tuổi (khoảng 100 con cái và 100 con đực) được chuyển vào đĩa Petri chứa nấm và để phát triển trong 24 giờ. Sau đó, trứng được tách ra và xử lý bằng 5-iodoindole (0,05 mM và 0,1 mM) hoặc avermectin (10 μg/ml) dưới dạng huyền phù trong nước cất vô trùng. Các huyền phù này (500 μl; khoảng 100 trứng) được chuyển vào các giếng của đĩa nuôi cấy mô 24 giếng và ủ ở 22 °C. Số lượng ấu trùng L2 được đếm sau 24 giờ ủ nhưng được coi là chết nếu các tế bào không di chuyển khi được kích thích bằng dây bạch kim mảnh. Thí nghiệm này được tiến hành trong hai giai đoạn, mỗi giai đoạn có sáu lần lặp lại. Dữ liệu từ cả hai thí nghiệm được kết hợp và trình bày. Phần trăm HR được tính như sau:
Tỷ lệ tử vong của ấu trùng được đánh giá bằng các quy trình đã được phát triển trước đó. Trứng giun tròn được thu thập và phôi được đồng bộ hóa bằng cách ấp trong nước cất vô trùng để tạo ra ấu trùng giai đoạn L2. Ấu trùng được đồng bộ hóa (khoảng 500 con giun tròn) được xử lý bằng 5-iodoindole (0,05 mM và 0,1 mM) hoặc avermectin (10 μg/ml) và nuôi trên đĩa Petri có chứa B. cinerea. Sau 48 giờ ủ ở 22 °C, giun tròn được thu thập trong nước cất vô trùng và kiểm tra sự hiện diện của các giai đoạn L2, L3 và L4. Sự hiện diện của giai đoạn L3 và L4 cho thấy sự biến đổi ấu trùng, trong khi sự hiện diện của giai đoạn L2 cho thấy không có sự biến đổi. Hình ảnh được thu thập bằng Hệ thống Hình ảnh Tế bào Kỹ thuật số iRiS™. Thí nghiệm này được tiến hành trong hai giai đoạn, mỗi giai đoạn có sáu lần lặp lại. Dữ liệu từ cả hai thí nghiệm được kết hợp và trình bày.
Độ độc của 5-iodoindole và avermectin đối với hạt giống được đánh giá bằng các thử nghiệm nảy mầm trên đĩa thạch Murashige và Skoog.62 Hạt giống B. oleracea và R. raphanistrum được ngâm trong nước cất vô trùng trong một ngày, rửa sạch với 1 ml ethanol 100%, khử trùng với 1 ml thuốc tẩy thương mại 50% (3% natri hypoclorit) trong 15 phút, và rửa lại năm lần với 1 ml nước vô trùng. Sau đó, hạt giống đã khử trùng được ép lên đĩa thạch nảy mầm chứa 0,86 g/l (0,2X) môi trường Murashige và Skoog và 0,7% thạch vi khuẩn có hoặc không có 5-iodoindole hoặc avermectin. Các đĩa được ủ ở 22 °C, và hình ảnh được chụp sau 3 ngày ủ. Thí nghiệm này được tiến hành trong hai giai đoạn, mỗi giai đoạn có sáu lần lặp lại.
Thời gian đăng bài: 26/02/2025