Tuyến trùng thông là một loài nội ký sinh di cư trong khu vực cách ly được biết là gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho hệ sinh thái rừng thông. Nghiên cứu hiện tại xem xét hoạt động diệt tuyến trùng của các indole halogen hóa đối với tuyến trùng thông và cơ chế hoạt động của chúng. Hoạt động diệt tuyến trùng của 5-iodoindole và avermectin (đối chứng dương tính) đối với tuyến trùng thông tương tự nhau và cao ở nồng độ thấp (10 μg/mL). 5-iodoindole làm giảm khả năng sinh sản, hoạt động sinh sản, tỷ lệ tử vong của phôi và ấu trùng, và hành vi vận động. Tương tác phân tử của các phối tử với các thụ thể kênh clorua có cổng glutamate đặc hiệu ở động vật không xương sống ủng hộ quan điểm cho rằng 5-iodoindole, giống như avermectin, liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động của thụ thể. 5-iodoindole cũng gây ra nhiều biến dạng kiểu hình khác nhau ở tuyến trùng, bao gồm sự co rút/sụp đổ cơ quan bất thường và tăng không bào. Những kết quả này cho thấy không bào có thể đóng vai trò trong cái chết do methyl hóa của tuyến trùng. Điều quan trọng là 5-iodoindole không độc hại đối với cả hai loài thực vật (bắp cải và củ cải). Do đó, nghiên cứu này chứng minh rằng việc sử dụng iodoindole trong điều kiện môi trường có thể kiểm soát được tình trạng cây thông bị héo.
Tuyến trùng gỗ thông (Bursaphelenchus xylophilus) thuộc họ tuyến trùng gỗ thông (PWN), là loài tuyến trùng nội ký sinh di cư được biết là gây ra thiệt hại sinh thái nghiêm trọng cho hệ sinh thái rừng thông1. Bệnh héo cây thông (PWD) do tuyến trùng gỗ thông gây ra đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng ở một số châu lục, bao gồm Châu Á và Châu Âu, và ở Bắc Mỹ, tuyến trùng này phá hủy các loài thông du nhập1,2. Sự suy giảm của cây thông là một vấn đề kinh tế lớn và triển vọng lây lan toàn cầu của nó là đáng lo ngại3. Các loài thông sau đây thường bị tuyến trùng tấn công nhất: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii và Pinus radiata4. Tuyến trùng thông là một căn bệnh nghiêm trọng có thể giết chết cây thông trong vòng vài tuần hoặc vài tháng sau khi nhiễm bệnh. Ngoài ra, sự bùng phát của tuyến trùng thông phổ biến ở nhiều hệ sinh thái khác nhau, do đó các chuỗi nhiễm trùng dai dẳng đã được thiết lập1.
Bursaphelenchus xylophilus là một loài tuyến trùng ký sinh thực vật kiểm dịch thuộc siêu họ Aphelenchoidea và nhánh 102.5. Tuyến trùng này ăn nấm và sinh sản trong mô gỗ của cây thông, phát triển thành bốn giai đoạn ấu trùng khác nhau: L1, L2, L3, L4 và một cá thể trưởng thành1,6. Trong điều kiện thiếu thức ăn, tuyến trùng thông chuyển sang giai đoạn ấu trùng chuyên biệt – dauer, ký sinh vật trung gian truyền bệnh – bọ vỏ thông (Monochamus alternatus) và được truyền sang cây thông khỏe mạnh. Ở vật chủ khỏe mạnh, tuyến trùng nhanh chóng di chuyển qua mô thực vật và ăn các tế bào nhu mô, dẫn đến một số phản ứng quá mẫn, cây thông héo và chết trong vòng một năm sau khi nhiễm bệnh1,7,8.
Kiểm soát sinh học tuyến trùng thông từ lâu đã là một thách thức, với các biện pháp kiểm dịch có từ thế kỷ 20. Các chiến lược hiện tại để kiểm soát tuyến trùng thông chủ yếu liên quan đến các biện pháp xử lý hóa học, bao gồm xông hơi gỗ và cấy thuốc diệt tuyến trùng vào thân cây. Các loại thuốc diệt tuyến trùng được sử dụng phổ biến nhất là avermectin và avermectin benzoate, thuộc họ avermectin. Những hóa chất đắt tiền này có hiệu quả cao đối với nhiều loài tuyến trùng và được coi là an toàn với môi trường9. Tuy nhiên, việc sử dụng lặp đi lặp lại các loại thuốc diệt tuyến trùng này dự kiến sẽ tạo ra áp lực chọn lọc, gần như chắc chắn sẽ dẫn đến sự xuất hiện của tuyến trùng thông kháng thuốc, như đã được chứng minh đối với một số loài côn trùng gây hại, chẳng hạn như Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella và tuyến trùng Trichostrongylus colubriformis và Ostertagia circumcincta, những loài đã dần phát triển khả năng kháng thuốc avermectin10,11,12. Do đó, cần phải nghiên cứu thường xuyên các kiểu kháng thuốc và sàng lọc liên tục các loại thuốc diệt tuyến trùng để tìm ra các biện pháp thay thế, tiết kiệm chi phí và thân thiện với môi trường để kiểm soát PVD. Trong những thập kỷ gần đây, một số tác giả đã đề xuất sử dụng chiết xuất thực vật, tinh dầu và chất dễ bay hơi làm tác nhân kiểm soát tuyến trùng13,14,15,16.
Gần đây chúng tôi đã chứng minh hoạt động diệt tuyến trùng của indole, một phân tử truyền tín hiệu liên tế bào và liên giới, ở Caenorhabditis elegans 17. Indole là một tín hiệu nội bào phổ biến trong sinh thái học vi sinh vật, kiểm soát nhiều chức năng ảnh hưởng đến sinh lý vi sinh vật, sự hình thành bào tử, độ ổn định của plasmid, khả năng kháng thuốc, sự hình thành màng sinh học và độc lực 18, 19. Hoạt động của indole và các dẫn xuất của nó đối với các loài tuyến trùng gây bệnh khác vẫn chưa được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu hoạt động diệt tuyến trùng của 34 indole đối với tuyến trùng thông và làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của 5-iodoindole mạnh nhất bằng cách sử dụng kính hiển vi, chụp ảnh tua nhanh thời gian và các thí nghiệm ghép nối phân tử, đồng thời đánh giá tác động độc hại của nó đối với thực vật bằng cách sử dụng xét nghiệm nảy mầm hạt.
Nồng độ indole cao (>1,0 mM) đã được báo cáo trước đây là có tác dụng diệt tuyến trùng đối với tuyến trùng17. Sau khi xử lý B. xylophilus (giai đoạn sống hỗn hợp) bằng indole hoặc 33 dẫn xuất indole khác nhau ở nồng độ 1 mM, tỷ lệ tử vong của B. xylophilus đã được đo bằng cách đếm số tuyến trùng sống và chết trong nhóm đối chứng và nhóm được xử lý. Năm indole thể hiện hoạt tính diệt tuyến trùng đáng kể; tỷ lệ sống sót của nhóm đối chứng không được xử lý là 95 ± 7% sau 24 giờ. Trong số 34 indole được thử nghiệm, 5-iodoindole và 4-fluoroindole ở nồng độ 1 mM gây tử vong 100%, trong khi 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate và 7-iodoindole gây tử vong khoảng 50% (Bảng 1).
Tác dụng của 5-iodoindole lên sự hình thành và chuyển hóa không bào của giun tròn gỗ thông. (A) Tác dụng của avermectin và 5-iodoindole lên giun tròn đực trưởng thành, (B) Trứng giun tròn giai đoạn L1 và (C) chuyển hóa của B. xylophilus, (i) không quan sát thấy không bào ở thời điểm 0 giờ, quá trình xử lý dẫn đến (ii) không bào, (iii) tích tụ nhiều không bào, (iv) sưng không bào, (v) hợp nhất không bào và (vi) hình thành không bào khổng lồ. Mũi tên đỏ biểu thị sự sưng không bào, mũi tên xanh biểu thị sự hợp nhất không bào và mũi tên đen biểu thị không bào khổng lồ. Thanh tỷ lệ = 50 μm.
Ngoài ra, nghiên cứu này cũng mô tả quá trình tuần tự gây chết do mêtan ở giun tròn thông (Hình 4C). Chết do mêtan là một loại chết tế bào không theo chương trình apoptosis liên quan đến sự tích tụ của các không bào tế bào chất nổi bật27. Các khiếm khuyết về hình thái được quan sát thấy ở giun tròn thông dường như có liên quan chặt chẽ đến cơ chế gây chết do mêtan. Kiểm tra bằng kính hiển vi tại các thời điểm khác nhau cho thấy các không bào khổng lồ được hình thành sau 20 giờ tiếp xúc với 5-iodoindole (0,1 mM). Các không bào vi mô được quan sát thấy sau 8 giờ xử lý và số lượng của chúng tăng lên sau 12 giờ. Một số không bào lớn được quan sát thấy sau 14 giờ. Một số không bào hợp nhất có thể nhìn thấy rõ sau 12–16 giờ xử lý, cho thấy sự hợp nhất của không bào là cơ sở của cơ chế gây chết do mêtan. Sau 20 giờ, một số không bào khổng lồ được tìm thấy trên khắp con giun. Những quan sát này đại diện cho báo cáo đầu tiên về metuosis ở C. elegans.
Ở những con giun được xử lý bằng 5-iodoindole, hiện tượng kết tụ và vỡ không bào cũng được quan sát thấy (Hình 5), bằng chứng là giun uốn cong và không bào được giải phóng vào môi trường. Sự phá vỡ không bào cũng được quan sát thấy ở màng vỏ trứng, vốn thường được L2 bảo quản nguyên vẹn trong quá trình nở (Hình bổ sung S2). Những quan sát này ủng hộ sự tham gia của sự tích tụ dịch và suy giảm điều hòa thẩm thấu, cũng như tổn thương tế bào có thể phục hồi (RCI), trong quá trình hình thành và mưng mủ không bào (Hình 5).
Giả thuyết về vai trò của iốt trong quá trình hình thành không bào quan sát được, chúng tôi đã nghiên cứu hoạt động diệt tuyến trùng của natri iodua (NaI) và kali iodua (KI). Tuy nhiên, ở nồng độ (0,1, 0,5 hoặc 1 mM), chúng không ảnh hưởng đến sự sống sót của tuyến trùng hoặc sự hình thành không bào (Hình bổ sung S5), mặc dù 1 mM KI có tác dụng diệt tuyến trùng nhẹ. Mặt khác, 7-iodoindole (1 hoặc 2 mM), giống như 5-iodoindole, gây ra nhiều không bào và biến dạng cấu trúc (Hình bổ sung S6). Hai iodoindole cho thấy các đặc điểm kiểu hình tương tự ở tuyến trùng thông, trong khi NaI và KI thì không. Điều thú vị là indole không gây ra sự hình thành không bào ở B. xylophilus ở các nồng độ đã thử nghiệm (dữ liệu không được hiển thị). Do đó, kết quả đã xác nhận rằng phức hợp indole-iodine chịu trách nhiệm cho quá trình hình thành không bào và chuyển hóa của B. xylophilus.
Trong số các indole được thử nghiệm về hoạt tính diệt tuyến trùng, 5-iodoindole có chỉ số trượt cao nhất là -5,89 kcal/mol, tiếp theo là 7-iodoindole (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindole (-4,33) và indole (-4,03) ( Hình 6 ). Liên kết hydro xương sống mạnh mẽ của 5-iodoindole với leucine 218 giúp ổn định sự liên kết của nó, trong khi tất cả các dẫn xuất indole khác liên kết với serine 260 thông qua liên kết hydro chuỗi bên. Trong số các iodoindole mô hình hóa khác, 2-iodoindole có giá trị liên kết là -5,248 kcal/mol, do liên kết hydro chính của nó với leucine 218. Các liên kết đã biết khác bao gồm 3-iodoindole (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4,0 kcal/mol) và 6-fluoroindole (-2,6 kcal/mol) (Hình bổ sung S8). Hầu hết các indole halogen hóa và bản thân indole, ngoại trừ 5-iodoindole và 2-iodoindole, đều tạo liên kết với serine 260. Thực tế là liên kết hydro với leucine 218 chỉ ra sự liên kết thụ thể-phối tử hiệu quả, như đã quan sát thấy ở ivermectin (Hình bổ sung S7), xác nhận rằng 5-iodoindole và 2-iodoindole, giống như ivermectin, liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động của thụ thể GluCL thông qua leucine 218 (Hình 6 và Hình bổ sung S8). Chúng tôi đề xuất rằng sự liên kết này là cần thiết để duy trì cấu trúc lỗ rỗng mở của phức hợp GluCL và bằng cách liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động của thụ thể GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin và ivermectin do đó duy trì kênh ion mở và cho phép hấp thụ chất lỏng.
Sự gắn kết phân tử của indole và indole halogen hóa với GluCL. Hướng liên kết của các phối tử (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole và (D) 5-iodoindole với vị trí hoạt động của GluCL. Protein được biểu diễn bằng một dải ruy băng, và các liên kết hydro của xương sống được thể hiện bằng các đường chấm màu vàng. (A′), (B′), (C′) và (D′) thể hiện sự tương tác của các phối tử tương ứng với các gốc axit amin xung quanh, và các liên kết hydro của chuỗi bên được biểu thị bằng các mũi tên chấm màu hồng.
Các thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá tác động độc hại của 5-iodoindole đối với sự nảy mầm của hạt bắp cải và củ cải. 5-iodoindole (0,05 hoặc 0,1 mM) hoặc avermectin (10 μg/mL) có ít hoặc không có tác động đến sự nảy mầm ban đầu và sự xuất hiện của cây con (Hình 7). Ngoài ra, không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy giữa tỷ lệ nảy mầm của các đối chứng không được xử lý và hạt được xử lý bằng 5-iodoindole hoặc avermectin. Tác động đến sự kéo dài rễ cọc và số lượng rễ bên được hình thành là không đáng kể, mặc dù 1 mM (gấp 10 lần nồng độ hoạt động của nó) của 5-iodoindole làm chậm một chút sự phát triển của rễ bên. Những kết quả này chỉ ra rằng 5-iodoindole không độc đối với tế bào thực vật và không can thiệp vào quá trình phát triển của thực vật ở nồng độ đã nghiên cứu.
Ảnh hưởng của 5-iodoindole lên sự nảy mầm của hạt. Sự nảy mầm, nảy mầm và ra rễ ngang của hạt B. oleracea và R. raphanistrum trên môi trường thạch Murashige và Skoog có hoặc không có avermectin hoặc 5-iodoindole. Sự nảy mầm được ghi nhận sau 3 ngày ủ ở 22°C.
Nghiên cứu này báo cáo một số trường hợp tuyến trùng bị tiêu diệt bởi indole. Quan trọng hơn, đây là báo cáo đầu tiên về việc iodoindole gây ra quá trình methyl hóa (một quá trình do sự tích tụ của các không bào nhỏ dần dần hợp nhất thành các không bào khổng lồ, cuối cùng dẫn đến vỡ màng và chết) ở lá thông, trong đó iodoindole thể hiện đặc tính diệt tuyến trùng đáng kể tương tự như thuốc diệt tuyến trùng thương mại avermectin.
Indole trước đây đã được báo cáo là có nhiều chức năng truyền tín hiệu ở cả sinh vật nhân sơ và nhân thực, bao gồm ức chế/hình thành màng sinh học, khả năng sống sót của vi khuẩn và khả năng gây bệnh19,32,33,34. Gần đây, các tác dụng điều trị tiềm năng của indole halogen hóa, ancaloit indole và các dẫn xuất indole bán tổng hợp đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu rộng rãi35,36,37. Ví dụ, indole halogen hóa đã được chứng minh là có khả năng tiêu diệt tế bào Escherichia coli và Staphylococcus aureus dai dẳng37. Ngoài ra, việc nghiên cứu hiệu quả của indole halogen hóa đối với các loài, chi và giới vi khuẩn khác cũng rất có giá trị khoa học, và nghiên cứu này là một bước tiến tới mục tiêu này.
Ở đây, chúng tôi đề xuất một cơ chế gây tử vong do 5-iodoindole ở C. elegans dựa trên tổn thương tế bào có thể hồi phục (RCI) và quá trình methyl hóa (Hình 4C và 5). Những thay đổi phù nề như phù nề và thoái hóa không bào là dấu hiệu của RCI và methyl hóa, biểu hiện dưới dạng các không bào khổng lồ trong tế bào chất48,49. RCI cản trở quá trình sản xuất năng lượng bằng cách giảm sản xuất ATP, gây ra sự suy yếu của bơm ATPase, hoặc phá vỡ màng tế bào và gây ra dòng Na+, Ca2+ và nước chảy vào nhanh chóng50,51,52. Không bào nội bào xuất hiện trong tế bào động vật do sự tích tụ dịch trong tế bào chất do dòng Ca2+ và nước chảy vào53. Điều thú vị là cơ chế gây tổn thương tế bào này có thể đảo ngược nếu tổn thương chỉ là tạm thời và các tế bào bắt đầu sản xuất ATP trong một khoảng thời gian nhất định, nhưng nếu tổn thương vẫn tiếp diễn hoặc trở nên tồi tệ hơn, các tế bào sẽ chết.54 Quan sát của chúng tôi cho thấy giun tròn được xử lý bằng 5-iodoindole không thể khôi phục quá trình tổng hợp sinh học bình thường sau khi tiếp xúc với điều kiện căng thẳng.
Kiểu hình methyl hóa do 5-iodoindole gây ra ở B. xylophilus có thể là do sự hiện diện của iốt và sự phân bố phân tử của nó, vì 7-iodoindole có tác dụng ức chế B. xylophilus yếu hơn 5-iodoindole (Bảng 1 và Hình bổ sung S6). Những kết quả này phần nào phù hợp với các nghiên cứu của Maltese và cộng sự (2014), những người đã báo cáo rằng sự chuyển vị của nhóm nitơ pyridyl trong indole từ vị trí para- sang vị trí meta- đã loại bỏ hiện tượng không bào, ức chế tăng trưởng và độc tính tế bào ở tế bào U251, cho thấy sự tương tác của phân tử với một vị trí hoạt động cụ thể trong protein là rất quan trọng27,44,45. Các tương tác giữa indole hoặc indole halogen hóa và thụ thể GluCL được quan sát thấy trong nghiên cứu này cũng ủng hộ quan điểm này, vì 5- và 2-iodoindole được phát hiện liên kết với thụ thể GluCL mạnh hơn các indole khác đã được kiểm tra (Hình 6 và Hình bổ sung S8). Iốt ở vị trí thứ hai hoặc thứ năm của indole được phát hiện liên kết với leucine 218 của thụ thể GluCL thông qua liên kết hydro xương sống, trong khi các indole halogen hóa khác và bản thân indole tạo liên kết hydro chuỗi bên yếu với serine 260 (Hình 6). Do đó, chúng tôi suy đoán rằng vị trí của halogen đóng vai trò quan trọng trong việc gây thoái hóa không bào, trong khi liên kết chặt chẽ của 5-iodoindole giữ cho kênh ion mở, do đó cho phép dòng dịch chảy vào nhanh chóng và phá vỡ không bào. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động chi tiết của 5-iodoindole vẫn chưa được xác định.
Trước khi ứng dụng thực tế 5-iodoindole, cần phân tích tác dụng độc hại của nó đối với cây trồng. Các thí nghiệm nảy mầm hạt của chúng tôi cho thấy 5-iodoindole không có tác động tiêu cực đến sự nảy mầm hạt hoặc các quá trình phát triển tiếp theo ở nồng độ nghiên cứu (Hình 7). Do đó, nghiên cứu này cung cấp cơ sở cho việc sử dụng 5-iodoindole trong môi trường sinh thái để kiểm soát tác hại của tuyến trùng thông đối với cây thông.
Các báo cáo trước đây đã chứng minh rằng liệu pháp dựa trên indole là một phương pháp tiềm năng để giải quyết vấn đề kháng kháng sinh và tiến triển ung thư55. Ngoài ra, indole còn có hoạt tính kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, chống đái tháo đường, kháng vi-rút, chống tăng sinh và chống lao, và có thể là cơ sở đầy hứa hẹn cho việc phát triển thuốc56,57. Nghiên cứu này lần đầu tiên gợi ý về tiềm năng sử dụng iốt như một tác nhân chống ký sinh trùng và tẩy giun sán.
Avermectin được phát hiện cách đây ba thập kỷ và đã giành giải Nobel năm 2015, và việc sử dụng nó như một loại thuốc tẩy giun sán vẫn đang được tiếp tục. Tuy nhiên, do sự phát triển nhanh chóng của tình trạng kháng thuốc avermectin ở tuyến trùng và côn trùng gây hại, cần có một chiến lược thay thế, chi phí thấp và thân thiện với môi trường để kiểm soát nhiễm trùng PWN trên cây thông. Nghiên cứu này cũng báo cáo cơ chế mà 5-iodoindole tiêu diệt tuyến trùng thông và 5-iodoindole có độc tính thấp đối với tế bào thực vật, mở ra triển vọng tốt cho việc ứng dụng thương mại trong tương lai.
Tất cả các thí nghiệm đều được Ủy ban Đạo đức của Đại học Yeungnam, Gyeongsan, Hàn Quốc chấp thuận và các phương pháp được thực hiện theo hướng dẫn của Ủy ban Đạo đức của Đại học Yeungnam.
Các thí nghiệm ấp trứng được thực hiện theo các quy trình đã được thiết lập43. Để đánh giá tỷ lệ nở (HR), giun tròn trưởng thành 1 ngày tuổi (khoảng 100 con cái và 100 con đực) được chuyển vào đĩa Petri chứa nấm và để phát triển trong 24 giờ. Sau đó, trứng được phân lập và xử lý bằng 5-iodoindole (0,05 mM và 0,1 mM) hoặc avermectin (10 μg/ml) dưới dạng huyền phù trong nước cất vô trùng. Các huyền phù này (500 μl; khoảng 100 trứng) được chuyển vào các giếng của đĩa nuôi cấy mô 24 giếng và ủ ở 22 °C. Đếm L2 được thực hiện sau 24 giờ ủ nhưng được coi là chết nếu các tế bào không di chuyển khi được kích thích bằng dây bạch kim mịn. Thí nghiệm này được tiến hành theo hai giai đoạn, mỗi giai đoạn có sáu lần lặp lại. Dữ liệu từ cả hai thí nghiệm đã được kết hợp và trình bày. Phần trăm HR được tính như sau:
Tỷ lệ tử vong của ấu trùng được đánh giá bằng các quy trình đã phát triển trước đó. Trứng giun tròn được thu thập và phôi được đồng bộ hóa bằng cách nở trong nước cất vô trùng để tạo ra ấu trùng giai đoạn L2. Ấu trùng đồng bộ hóa (khoảng 500 con giun tròn) được xử lý bằng 5-iodoindole (0,05 mM và 0,1 mM) hoặc avermectin (10 μg/ml) và nuôi trên đĩa Petri B. cinerea. Sau 48 giờ ủ ở 22 °C, giun tròn được thu thập trong nước cất vô trùng và kiểm tra sự hiện diện của các giai đoạn L2, L3 và L4. Sự hiện diện của các giai đoạn L3 và L4 cho thấy sự chuyển đổi ấu trùng, trong khi sự hiện diện của giai đoạn L2 cho thấy không có sự chuyển đổi. Hình ảnh được thu thập bằng Hệ thống hình ảnh tế bào kỹ thuật số iRiS™. Thí nghiệm này được tiến hành trong hai giai đoạn, mỗi giai đoạn có sáu lần lặp lại. Dữ liệu từ cả hai thí nghiệm đã được kết hợp và trình bày.
Độc tính của 5-iodoindole và avermectin đối với hạt giống được đánh giá bằng cách sử dụng các thử nghiệm nảy mầm trên đĩa thạch Murashige và Skoog.62 Hạt B. oleracea và R. raphanistrum trước tiên được ngâm trong nước cất vô trùng trong một ngày, rửa bằng 1 ml etanol 100%, khử trùng bằng 1 ml thuốc tẩy thương mại 50% (natri hypoclorit 3%) trong 15 phút và rửa năm lần bằng 1 ml nước vô trùng. Sau đó, hạt giống đã khử trùng được ấn lên đĩa thạch nảy mầm chứa 0,86 g/l (0,2X) môi trường Murashige và Skoog và 0,7% thạch vi khuẩn có hoặc không có 5-iodoindole hoặc avermectin. Sau đó, các đĩa được ủ ở 22 °C và chụp ảnh sau 3 ngày ủ. Thí nghiệm này được tiến hành theo hai giai đoạn, mỗi giai đoạn có sáu lần lặp lại.
Thời gian đăng: 26-02-2025