Nghiên cứu này đánh giá mức độ gây chết người, mức độ gây hại dưới ngưỡng và độc tính của các chất thương mại.cypermethrinThử nghiệm độ bền của chế phẩm cypermethrin đối với nòng nọc lưỡng cư được thực hiện trên các loài ếch nhái. Trong thử nghiệm cấp tính, nồng độ 100–800 μg/L được thử nghiệm trong 96 giờ. Trong thử nghiệm mãn tính, nồng độ cypermethrin tự nhiên (1, 3, 6 và 20 μg/L) được thử nghiệm về tỷ lệ tử vong, tiếp theo là thử nghiệm vi nhân và bất thường nhân tế bào hồng cầu trong 7 ngày. Giá trị LC50 của chế phẩm cypermethrin thương mại đối với nòng nọc là 273,41 μg L−1. Trong thử nghiệm mãn tính, nồng độ cao nhất (20 μg L−1) dẫn đến tỷ lệ tử vong hơn 50%, vì nó đã giết chết một nửa số nòng nọc được thử nghiệm. Thử nghiệm vi nhân cho thấy kết quả đáng kể ở nồng độ 6 và 20 μg L−1 và một số bất thường nhân đã được phát hiện, cho thấy chế phẩm cypermethrin thương mại có tiềm năng gây độc gen đối với P. gracilis. Cypermethrin là chất có nguy cơ cao đối với loài này, cho thấy nó có thể gây ra nhiều vấn đề và ảnh hưởng đến động thái của hệ sinh thái này trong ngắn hạn và dài hạn. Do đó, có thể kết luận rằng các chế phẩm cypermethrin thương mại có tác động độc hại đối với P. gracilis.
Do hoạt động nông nghiệp liên tục mở rộng và ứng dụng sâu rộngkiểm soát dịch hạiCác biện pháp này khiến động vật thủy sinh thường xuyên tiếp xúc với thuốc trừ sâu1,2. Ô nhiễm nguồn nước gần các cánh đồng nông nghiệp có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tồn của các sinh vật không phải mục tiêu như động vật lưỡng cư.
Động vật lưỡng cư ngày càng trở nên quan trọng trong việc đánh giá các ma trận môi trường. Ếch được coi là chỉ thị sinh học tốt cho các chất ô nhiễm môi trường do các đặc điểm độc đáo của chúng như vòng đời phức tạp, tốc độ tăng trưởng ấu trùng nhanh, trạng thái dinh dưỡng, da thấm nước10,11, phụ thuộc vào nước để sinh sản12 và trứng không được bảo vệ11,13,14. Ếch nước nhỏ (Physalaemus gracilis), thường được gọi là ếch khóc, đã được chứng minh là loài chỉ thị sinh học cho ô nhiễm thuốc trừ sâu4,5,6,7,15. Loài này được tìm thấy ở các vùng nước tù đọng, khu vực được bảo vệ hoặc khu vực có môi trường sống đa dạng ở Argentina, Uruguay, Paraguay và Brazil1617 và được IUCN xếp vào loại ổn định do phân bố rộng rãi và khả năng thích nghi với các môi trường sống khác nhau18.
Các tác động dưới ngưỡng gây chết đã được báo cáo ở động vật lưỡng cư sau khi tiếp xúc với cypermethrin, bao gồm những thay đổi về hành vi, hình thái và sinh hóa ở nòng nọc23,24,25, thay đổi tỷ lệ tử vong và thời gian biến thái, thay đổi enzym, giảm tỷ lệ nở trứng24,25, tăng động26, ức chế hoạt động cholinesterase27 và thay đổi khả năng bơi lội7,28. Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác động gây độc gen của cypermethrin ở động vật lưỡng cư còn hạn chế. Do đó, việc đánh giá tính nhạy cảm của các loài ếch nhái đối với cypermethrin là rất quan trọng.
Ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển bình thường của động vật lưỡng cư, nhưng tác động bất lợi nghiêm trọng nhất là tổn thương di truyền DNA do tiếp xúc với thuốc trừ sâu13. Phân tích hình thái tế bào máu là một chỉ thị sinh học quan trọng về ô nhiễm và độc tính tiềm tàng của một chất đối với các loài hoang dã29. Xét nghiệm vi nhân là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để xác định độc tính di truyền của hóa chất trong môi trường30. Đây là một phương pháp nhanh chóng, hiệu quả và không tốn kém, là một chỉ thị tốt về ô nhiễm hóa chất đối với các sinh vật như động vật lưỡng cư31,32 và có thể cung cấp thông tin về việc tiếp xúc với các chất gây ô nhiễm độc tính di truyền33.
Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá tiềm năng độc hại của các chế phẩm cypermethrin thương mại đối với nòng nọc thủy sinh nhỏ bằng cách sử dụng thử nghiệm vi nhân và đánh giá rủi ro sinh thái.
Tỷ lệ tử vong tích lũy (%) của nòng nọc P. gracilis tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của cypermethrin thương mại trong giai đoạn cấp tính của thử nghiệm.
Tỷ lệ tử vong tích lũy (%) của nòng nọc P. gracilis tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của cypermethrin thương mại trong một thử nghiệm mãn tính.
Tỷ lệ tử vong cao được quan sát thấy là kết quả của tác động gây độc gen ở động vật lưỡng cư tiếp xúc với các nồng độ cypermethrin khác nhau (6 và 20 μg/L), được chứng minh bằng sự hiện diện của vi nhân (MN) và các bất thường hạt nhân trong hồng cầu. Sự hình thành MN cho thấy lỗi trong quá trình phân bào và có liên quan đến sự gắn kết kém của nhiễm sắc thể với vi ống, các khiếm khuyết trong các phức hợp protein chịu trách nhiệm hấp thụ và vận chuyển nhiễm sắc thể, lỗi trong sự phân tách nhiễm sắc thể và lỗi trong sửa chữa tổn thương DNA38,39 và có thể liên quan đến stress oxy hóa do thuốc trừ sâu gây ra40,41. Các bất thường khác được quan sát thấy ở tất cả các nồng độ được đánh giá. Nồng độ cypermethrin tăng lên làm tăng các bất thường hạt nhân trong hồng cầu lần lượt là 5% và 20% ở liều thấp nhất (1 μg/L) và cao nhất (20 μg/L). Ví dụ, những thay đổi trong DNA của một loài có thể gây ra hậu quả nghiêm trọng đối với cả sự sống sót ngắn hạn và dài hạn, dẫn đến suy giảm quần thể, thay đổi khả năng sinh sản, giao phối cận huyết, mất đa dạng di truyền và thay đổi tỷ lệ di cư. Tất cả những yếu tố này đều có thể ảnh hưởng đến sự sống còn và duy trì của loài42,43. Sự hình thành các bất thường hồng cầu có thể cho thấy sự tắc nghẽn trong quá trình phân chia tế bào chất, dẫn đến sự phân chia tế bào bất thường (hồng cầu hai nhân)44,45; nhân đa thùy là những phần nhô ra của màng nhân với nhiều thùy46, trong khi các bất thường hồng cầu khác có thể liên quan đến sự khuếch đại DNA, chẳng hạn như thận nhân/bọt nhân47. Sự hiện diện của hồng cầu không nhân có thể cho thấy sự vận chuyển oxy bị suy giảm, đặc biệt là trong nước bị ô nhiễm48,49. Sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) biểu thị sự chết của tế bào50.
Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh tác động gây độc gen của cypermethrin. Kabaña et al.51 đã chứng minh sự hiện diện của vi nhân và những thay đổi hạt nhân như tế bào hai nhân và tế bào chết theo chương trình ở tế bào Odontophrynus americanus sau khi tiếp xúc với nồng độ cypermethrin cao (5000 và 10.000 μg L−1) trong 96 giờ. Hiện tượng chết theo chương trình do cypermethrin gây ra cũng được phát hiện ở P. biligonigerus52 và Rhinella arenarum53. Những kết quả này cho thấy cypermethrin có tác động gây độc gen đối với nhiều sinh vật thủy sinh và xét nghiệm MN và ENA có thể là một chỉ báo về tác động dưới ngưỡng gây chết đối với động vật lưỡng cư và có thể áp dụng cho các loài bản địa và quần thể hoang dã tiếp xúc với chất độc12.
Các chế phẩm thương mại của cypermethrin gây ra mối nguy hại cao cho môi trường (cả cấp tính và mãn tính), với nồng độ chất độc hại (HQ) vượt quá mức của Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA)54, có thể ảnh hưởng xấu đến loài nếu có mặt trong môi trường. Trong đánh giá rủi ro mãn tính, NOEC gây tử vong là 3 μg L−1, khẳng định rằng nồng độ tìm thấy trong nước có thể gây rủi ro cho loài55. NOEC gây chết đối với ấu trùng R. arenarum tiếp xúc với hỗn hợp endosulfan và cypermethrin là 500 μg L−1 sau 168 giờ; giá trị này giảm xuống còn 0,0005 μg L−1 sau 336 giờ. Các tác giả chỉ ra rằng thời gian tiếp xúc càng lâu, nồng độ gây hại cho loài càng thấp. Điều quan trọng cần nhấn mạnh là các giá trị NOEC cao hơn so với P. gracilis ở cùng thời gian tiếp xúc, cho thấy phản ứng của loài đối với cypermethrin là đặc trưng theo loài. Hơn nữa, về tỷ lệ tử vong, giá trị CHQ của P. gracilis sau khi tiếp xúc với cypermethrin đạt 64,67, cao hơn giá trị tham chiếu do Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ đặt ra54, và giá trị CHQ của ấu trùng R. arenarum cũng cao hơn giá trị này (CHQ > 388,00 sau 336 giờ), cho thấy các loại thuốc trừ sâu được nghiên cứu gây ra rủi ro cao cho một số loài lưỡng cư. Xét rằng P. gracilis cần khoảng 30 ngày để hoàn thành quá trình biến thái56, có thể kết luận rằng nồng độ cypermethrin được nghiên cứu có thể góp phần làm giảm quần thể bằng cách ngăn chặn các cá thể bị nhiễm bệnh bước vào giai đoạn trưởng thành hoặc sinh sản ở độ tuổi sớm.
Trong đánh giá rủi ro tính toán về vi nhân và các bất thường nhân hồng cầu khác, giá trị CHQ dao động từ 14,92 đến 97,00, cho thấy cypermethrin có nguy cơ gây độc gen tiềm tàng đối với P. gracilis ngay cả trong môi trường sống tự nhiên của chúng. Tính đến tỷ lệ tử vong, nồng độ tối đa của các hợp chất ngoại lai mà P. gracilis có thể chịu được là 4,24 μg L−1. Tuy nhiên, nồng độ thấp tới 1 μg/L cũng cho thấy tác động gây độc gen. Điều này có thể dẫn đến sự gia tăng số lượng cá thể bất thường57 và ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của loài trong môi trường sống của chúng, dẫn đến sự suy giảm quần thể lưỡng cư.
Các chế phẩm thương mại của thuốc trừ sâu cypermethrin cho thấy độc tính cấp tính và mãn tính cao đối với P. gracilis. Tỷ lệ tử vong cao hơn đã được quan sát thấy, có thể do tác động độc hại, được chứng minh bằng sự hiện diện của vi nhân và các bất thường nhân hồng cầu, đặc biệt là nhân răng cưa, nhân thùy và nhân dạng túi. Ngoài ra, loài được nghiên cứu cho thấy nguy cơ môi trường gia tăng, cả cấp tính và mãn tính. Những dữ liệu này, kết hợp với các nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu chúng tôi, cho thấy ngay cả các chế phẩm thương mại khác nhau của cypermethrin vẫn gây ra sự suy giảm hoạt động acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BChE) và stress oxy hóa58, và dẫn đến những thay đổi trong hoạt động bơi lội và dị tật miệng59 ở P. gracilis, cho thấy các chế phẩm thương mại của cypermethrin có độc tính gây chết và dưới ngưỡng gây chết cao đối với loài này. Hartmann et al. 60 nhận thấy rằng các chế phẩm thương mại của cypermethrin là độc hại nhất đối với P. gracilis và một loài khác cùng chi (P. cuvieri) so với chín loại thuốc trừ sâu khác. Điều này cho thấy rằng nồng độ cypermethrin được pháp luật cho phép để bảo vệ môi trường có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao và suy giảm quần thể lâu dài.
Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá độc tính của thuốc trừ sâu đối với động vật lưỡng cư, vì nồng độ tìm thấy trong môi trường có thể gây tỷ lệ tử vong cao và tiềm ẩn nguy cơ đối với P. gracilis. Cần khuyến khích nghiên cứu trên các loài động vật lưỡng cư, vì dữ liệu về các sinh vật này còn khan hiếm, đặc biệt là các loài ở Brazil.
Thử nghiệm độc tính mãn tính kéo dài 168 giờ (7 ngày) trong điều kiện tĩnh và nồng độ dưới ngưỡng gây chết là: 1, 3, 6 và 20 μg ai L−1. Trong cả hai thí nghiệm, 10 nòng nọc mỗi nhóm điều trị được đánh giá với sáu lần lặp lại, tổng cộng 60 nòng nọc cho mỗi nồng độ. Trong khi đó, nhóm chỉ dùng nước được dùng làm đối chứng âm. Mỗi thiết lập thí nghiệm bao gồm một đĩa thủy tinh vô trùng có dung tích 500 ml và mật độ 1 nòng nọc trên 50 ml dung dịch. Bình được đậy bằng màng polyetylen để ngăn ngừa sự bay hơi và được sục khí liên tục.
Nước được phân tích hóa học để xác định nồng độ thuốc trừ sâu ở các thời điểm 0, 96 và 168 giờ. Theo Sabin et al. 68 và Martins et al. 69, các phân tích được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Phân tích Thuốc trừ sâu (LARP) của Đại học Liên bang Santa Maria bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp với phổ khối tứ cực ba lần (máy Varian model 1200, Palo Alto, California, Hoa Kỳ). Việc xác định định lượng thuốc trừ sâu trong nước được trình bày trong tài liệu bổ sung (Bảng SM1).
Đối với xét nghiệm vi nhân (MNT) và xét nghiệm bất thường nhân hồng cầu (RNA), 15 nòng nọc từ mỗi nhóm điều trị đã được phân tích. Nòng nọc được gây mê bằng lidocaine 5% (50 mg/g) và mẫu máu được lấy bằng cách chọc tim bằng ống tiêm dùng một lần có chứa heparin. Tiêu bản máu được chuẩn bị trên lam kính hiển vi vô trùng, làm khô trong không khí, cố định bằng methanol 100% (4 °C) trong 2 phút, sau đó nhuộm bằng dung dịch Giemsa 10% trong 15 phút trong bóng tối. Sau khi kết thúc quá trình, lam kính được rửa bằng nước cất để loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa và làm khô ở nhiệt độ phòng.
Ít nhất 1000 tế bào hồng cầu từ mỗi nòng nọc được phân tích bằng kính hiển vi 100× với vật kính 71 để xác định sự hiện diện của MN và ENA. Tổng cộng 75.796 tế bào hồng cầu từ nòng nọc đã được đánh giá dựa trên nồng độ cypermethrin và nhóm đối chứng. Độc tính di truyền được phân tích theo phương pháp của Carrasco et al. và Fenech et al.38,72 bằng cách xác định tần suất của các tổn thương hạt nhân sau: (1) tế bào không nhân: tế bào không có nhân; (2) tế bào chết theo chương trình: phân mảnh nhân, chết tế bào theo chương trình; (3) tế bào hai nhân: tế bào có hai nhân; (4) chồi nhân hoặc tế bào phồng: tế bào có nhân với các phần nhô ra nhỏ của màng nhân, các phồng có kích thước tương tự như vi nhân; (5) tế bào bị phân giải nhân: tế bào chỉ còn lại đường viền của nhân mà không có vật chất bên trong; (6) tế bào có khuyết: tế bào có nhân với các vết nứt hoặc khuyết rõ ràng về hình dạng, còn được gọi là nhân hình thận; (7) tế bào thùy: tế bào có phần nhô ra của nhân lớn hơn các túi đã đề cập ở trên; và (8) tế bào nhỏ: tế bào có nhân cô đặc và tế bào chất giảm. Các thay đổi được so sánh với kết quả kiểm soát âm tính.
Kết quả thử nghiệm độc tính cấp tính (LC50) được phân tích bằng phần mềm GBasic và phương pháp TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Dữ liệu thử nghiệm mãn tính được kiểm tra trước về tính chuẩn của sai số (Shapiro-Wilks) và tính đồng nhất của phương sai (Bartlett). Kết quả được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Kiểm định Tukey được sử dụng để so sánh dữ liệu với nhau, và kiểm định Dunnett được sử dụng để so sánh dữ liệu giữa nhóm điều trị và nhóm đối chứng âm tính.
Dữ liệu LOEC và NOEC được phân tích bằng phép thử Dunnett. Các phép thử thống kê được thực hiện bằng phần mềm Statistica 8.0 (StatSoft) với mức ý nghĩa 95% (p < 0,05).
Thời gian đăng bài: 13/03/2025