Nghiên cứu này đánh giá mức độ gây chết, mức độ gây chết dưới mức và độc tính của các sản phẩm thương mạicypermethrincông thức cho nòng nọc không đuôi. Trong thử nghiệm cấp tính, nồng độ 100–800 μg/L đã được thử nghiệm trong 96 giờ. Trong thử nghiệm mãn tính, nồng độ cypermethrin tự nhiên (1, 3, 6 và 20 μg/L) đã được thử nghiệm về tỷ lệ tử vong, tiếp theo là thử nghiệm vi nhân và bất thường nhân hồng cầu trong 7 ngày. LC50 của công thức cypermethrin thương mại đối với nòng nọc là 273,41 μg L−1. Trong thử nghiệm mãn tính, nồng độ cao nhất (20 μg L−1) dẫn đến tỷ lệ tử vong lớn hơn 50%, vì nó giết chết một nửa số nòng nọc được thử nghiệm. Thử nghiệm vi nhân cho thấy kết quả đáng kể ở 6 và 20 μg L−1 và một số bất thường nhân đã được phát hiện, cho thấy công thức cypermethrin thương mại có tiềm năng gây độc gen đối với P. gracilis. Cypermethrin có nguy cơ cao đối với loài này, cho thấy nó có thể gây ra nhiều vấn đề và ảnh hưởng đến động lực của hệ sinh thái này trong ngắn hạn và dài hạn. Do đó, có thể kết luận rằng các chế phẩm cypermethrin thương mại có tác dụng độc hại đối với P. gracilis.
Do sự mở rộng liên tục của các hoạt động nông nghiệp và ứng dụng chuyên sâu củakiểm soát dịch hạicác biện pháp, động vật thủy sinh thường xuyên tiếp xúc với thuốc trừ sâu1,2. Ô nhiễm nguồn nước gần các cánh đồng nông nghiệp có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và sự sống còn của các sinh vật không phải mục tiêu như động vật lưỡng cư.
Lưỡng cư ngày càng trở nên quan trọng trong việc đánh giá các ma trận môi trường. Động vật không xương sống được coi là sinh vật chỉ thị tốt về các chất ô nhiễm môi trường nhờ các đặc điểm độc đáo như vòng đời phức tạp, tốc độ phát triển ấu trùng nhanh, trạng thái dinh dưỡng, da thấm nước10,11, phụ thuộc vào nước để sinh sản12 và trứng không được bảo vệ11,13,14. Ếch nước nhỏ (Physalaemus gracilis), thường được gọi là ếch khóc, đã được chứng minh là một loài sinh vật chỉ thị về ô nhiễm thuốc trừ sâu4,5,6,7,15. Loài này được tìm thấy ở các vùng nước tĩnh, khu vực được bảo vệ hoặc các khu vực có môi trường sống thay đổi ở Argentina, Uruguay, Paraguay và Brazil1617 và được IUCN phân loại là ổn định do phân bố rộng rãi và khả năng chịu đựng các môi trường sống khác nhau18.
Tác dụng dưới ngưỡng gây chết đã được báo cáo ở động vật lưỡng cư sau khi tiếp xúc với cypermethrin, bao gồm những thay đổi về hành vi, hình thái và sinh hóa ở nòng nọc23,24,25, thay đổi thời gian chết và biến thái, thay đổi về enzyme, giảm tỷ lệ nở24,25, tăng động26, ức chế hoạt động của cholinesterase27 và thay đổi khả năng bơi7,28. Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác dụng gây độc gen của cypermethrin ở động vật lưỡng cư còn hạn chế. Do đó, việc đánh giá mức độ nhạy cảm của các loài ếch không đuôi với cypermethrin là rất quan trọng.
Ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển bình thường của lưỡng cư, nhưng tác động tiêu cực nghiêm trọng nhất là tổn thương di truyền DNA do tiếp xúc với thuốc trừ sâu13. Phân tích hình thái tế bào máu là một chỉ số sinh học quan trọng về ô nhiễm và độc tính tiềm ẩn của một chất đối với các loài hoang dã29. Xét nghiệm vi nhân là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để xác định độc tính di truyền của hóa chất trong môi trường30. Đây là một phương pháp nhanh chóng, hiệu quả và không tốn kém, là một chỉ số tốt về ô nhiễm hóa chất đối với các sinh vật như lưỡng cư31,32 và có thể cung cấp thông tin về việc tiếp xúc với các chất ô nhiễm gây độc gen33.
Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá khả năng gây độc của các chế phẩm cypermethrin thương mại đối với nòng nọc nhỏ dưới nước bằng cách sử dụng thử nghiệm vi nhân và đánh giá rủi ro sinh thái.
Tỷ lệ tử vong tích lũy (%) của nòng nọc P. gracilis tiếp xúc với các nồng độ cypermethrin thương mại khác nhau trong giai đoạn cấp tính của thử nghiệm.
Tỷ lệ tử vong tích lũy (%) của nòng nọc P. gracilis tiếp xúc với các nồng độ cypermethrin thương mại khác nhau trong quá trình thử nghiệm mãn tính.
Tỷ lệ tử vong cao được quan sát thấy là kết quả của tác động gây độc gen ở các loài lưỡng cư tiếp xúc với các nồng độ cypermethrin khác nhau (6 và 20 μg/L), bằng chứng là sự hiện diện của nhân nhỏ (MN) và các bất thường về nhân trong hồng cầu. Sự hình thành MN chỉ ra các lỗi trong nguyên phân và liên quan đến sự liên kết kém của nhiễm sắc thể với vi ống, các khiếm khuyết trong phức hợp protein chịu trách nhiệm cho việc hấp thụ và vận chuyển nhiễm sắc thể, các lỗi trong sự phân ly nhiễm sắc thể và các lỗi trong quá trình sửa chữa tổn thương DNA38,39 và có thể liên quan đến stress oxy hóa do thuốc trừ sâu gây ra40,41. Các bất thường khác đã được quan sát thấy ở tất cả các nồng độ được đánh giá. Nồng độ cypermethrin tăng làm tăng các bất thường về nhân trong hồng cầu lần lượt là 5% và 20% ở liều thấp nhất (1 μg/L) và cao nhất (20 μg/L). Ví dụ, những thay đổi trong DNA của một loài có thể gây ra hậu quả nghiêm trọng cho cả sự sống còn ngắn hạn và dài hạn, dẫn đến suy giảm quần thể, thay đổi sức khỏe sinh sản, cận huyết, mất đa dạng di truyền và thay đổi tỷ lệ di cư. Tất cả những yếu tố này đều có thể ảnh hưởng đến sự tồn tại và duy trì của loài42,43. Sự hình thành các bất thường hồng cầu có thể chỉ ra sự tắc nghẽn trong quá trình phân chia tế bào, dẫn đến sự phân chia tế bào bất thường (hồng cầu hai nhân)44,45; nhân đa thùy là những phần lồi ra của màng nhân với nhiều thùy46, trong khi các bất thường hồng cầu khác có thể liên quan đến sự khuếch đại DNA, chẳng hạn như thận nhân/bọng nước47. Sự hiện diện của hồng cầu không nhân có thể chỉ ra sự suy giảm vận chuyển oxy, đặc biệt là trong nước bị ô nhiễm48,49. Chết rụng tế bào theo chương trình (apoptosis) chỉ ra sự chết tế bào50.
Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh tác dụng gây độc gen của cypermethrin. Kabaña và cộng sự51 đã chứng minh sự hiện diện của các vi nhân và các thay đổi trong nhân như tế bào hai nhân và tế bào chết rụng theo chương trình (apoptosis) trong tế bào Odontophrynus americanus sau khi tiếp xúc với nồng độ cypermethrin cao (5000 và 10.000 μg L−1) trong 96 giờ. Quá trình chết rụng theo chương trình do cypermethrin gây ra cũng được phát hiện ở P. biligonigerus52 và Rhinella arenarum53. Những kết quả này cho thấy cypermethrin có tác dụng gây độc gen đối với nhiều loài sinh vật thủy sinh và xét nghiệm MN và ENA có thể là một chỉ báo về tác dụng dưới ngưỡng gây chết đối với lưỡng cư và có thể áp dụng cho các loài bản địa và quần thể hoang dã tiếp xúc với chất độc12.
Các công thức thương mại của cypermethrin gây ra mối nguy hiểm cao cho môi trường (cả cấp tính và mãn tính), với HQ vượt quá mức của Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA)54 có thể ảnh hưởng xấu đến loài nếu có trong môi trường. Trong đánh giá rủi ro mãn tính, NOEC đối với tỷ lệ tử vong là 3 μg L−1, xác nhận rằng nồng độ tìm thấy trong nước có thể gây nguy hiểm cho loài55. NOEC gây chết đối với ấu trùng R. arenarum tiếp xúc với hỗn hợp endosulfan và cypermethrin là 500 μg L−1 sau 168 giờ; giá trị này giảm xuống còn 0,0005 μg L−1 sau 336 giờ. Các tác giả chỉ ra rằng thời gian tiếp xúc càng dài thì nồng độ gây hại cho loài càng thấp. Điều quan trọng nữa là phải nhấn mạnh rằng các giá trị NOEC cao hơn giá trị của P. gracilis tại cùng thời điểm tiếp xúc, cho thấy phản ứng của loài đối với cypermethrin là đặc trưng cho từng loài. Hơn nữa, về tỷ lệ tử vong, giá trị CHQ của P. gracilis sau khi tiếp xúc với cypermethrin đạt 64,67, cao hơn giá trị tham chiếu do Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ quy định54, và giá trị CHQ của ấu trùng R. arenarum cũng cao hơn giá trị này (CHQ > 388,00 sau 336 giờ), cho thấy các loại thuốc trừ sâu được nghiên cứu có nguy cơ cao đối với một số loài lưỡng cư. Xét thấy P. gracilis cần khoảng 30 ngày để hoàn thành quá trình biến thái56, có thể kết luận rằng nồng độ cypermethrin được nghiên cứu có thể góp phần làm suy giảm quần thể bằng cách ngăn cản các cá thể bị nhiễm bệnh bước vào giai đoạn trưởng thành hoặc sinh sản sớm.
Trong đánh giá rủi ro được tính toán về vi nhân và các bất thường khác ở nhân hồng cầu, giá trị CHQ dao động từ 14,92 đến 97,00, cho thấy cypermethrin có nguy cơ gây độc gen tiềm ẩn đối với P. gracilis ngay cả trong môi trường sống tự nhiên của nó. Có tính đến tỷ lệ tử vong, nồng độ tối đa của các hợp chất ngoại lai mà P. gracilis dung nạp được là 4,24 μg L−1. Tuy nhiên, nồng độ thấp tới 1 μg/L cũng cho thấy tác động gây độc gen. Thực tế này có thể dẫn đến sự gia tăng số lượng cá thể bất thường57 và ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của các loài trong môi trường sống của chúng, dẫn đến sự suy giảm quần thể lưỡng cư.
Các công thức thương mại của thuốc trừ sâu cypermethrin cho thấy độc tính cấp tính và mãn tính cao đối với P. gracilis. Tỷ lệ tử vong cao hơn đã được quan sát thấy, có thể là do tác dụng độc hại, bằng chứng là sự hiện diện của các vi nhân và bất thường của nhân hồng cầu, đặc biệt là nhân răng cưa, nhân thùy và nhân túi. Ngoài ra, các loài được nghiên cứu cho thấy các rủi ro môi trường tăng lên, cả cấp tính và mãn tính. Những dữ liệu này, kết hợp với các nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu của chúng tôi, cho thấy ngay cả các công thức thương mại khác nhau của cypermethrin vẫn gây ra giảm hoạt động của acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BChE) và stress oxy hóa58, và dẫn đến những thay đổi trong hoạt động bơi lội và dị tật miệng59 ở P. gracilis, cho thấy rằng các công thức thương mại của cypermethrin có độc tính gây chết và bán gây chết cao đối với loài này. Hartmann và cộng sự 60 phát hiện ra rằng các công thức thương mại của cypermethrin là độc nhất đối với P. gracilis và một loài khác cùng chi (P. cuvieri) so với chín loại thuốc trừ sâu khác. Điều này cho thấy nồng độ cypermethrin được chấp thuận hợp pháp để bảo vệ môi trường có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao và suy giảm quần thể lâu dài.
Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá độc tính của thuốc trừ sâu đối với động vật lưỡng cư, vì nồng độ tìm thấy trong môi trường có thể gây tử vong cao và tiềm ẩn nguy cơ đối với P. gracilis. Nghiên cứu về các loài lưỡng cư nên được khuyến khích, vì dữ liệu về các sinh vật này còn khan hiếm, đặc biệt là các loài ở Brazil.
Thử nghiệm độc tính mãn tính kéo dài 168 giờ (7 ngày) trong điều kiện tĩnh và nồng độ dưới ngưỡng gây chết là: 1, 3, 6 và 20 μg ai L−1. Trong cả hai thí nghiệm, 10 nòng nọc trên mỗi nhóm xử lý được đánh giá với sáu lần lặp lại, tổng cộng 60 nòng nọc trên mỗi nồng độ. Trong khi đó, nghiệm thức chỉ dùng nước được dùng làm đối chứng âm. Mỗi thiết bị thí nghiệm bao gồm một đĩa thủy tinh vô trùng có dung tích 500 ml và mật độ 1 nòng nọc trên 50 ml dung dịch. Bình được phủ màng polyethylene để ngăn bay hơi và được sục khí liên tục.
Nước được phân tích hóa học để xác định nồng độ thuốc trừ sâu tại các thời điểm 0, 96 và 168 giờ. Theo Sabin và cộng sự 68 và Martins và cộng sự 69, các phân tích được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Phân tích Thuốc trừ sâu (LARP) của Đại học Liên bang Santa Maria bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ ba tứ cực (mô hình Varian 1200, Palo Alto, California, Hoa Kỳ). Việc xác định định lượng thuốc trừ sâu trong nước được trình bày dưới dạng tài liệu bổ sung (Bảng SM1).
Đối với xét nghiệm vi nhân (MNT) và xét nghiệm bất thường nhân hồng cầu (RNA), 15 nòng nọc từ mỗi nhóm điều trị đã được phân tích. Nòng nọc được gây mê bằng lidocaine 5% (50 mg g-170) và mẫu máu được lấy bằng cách chọc tim bằng ống tiêm dùng một lần có tẩm heparin. Các mẫu máu được chuẩn bị trên các phiến kính hiển vi vô trùng, sấy khô trong không khí, cố định bằng methanol 100% (4 °C) trong 2 phút, sau đó nhuộm bằng dung dịch Giemsa 10% trong 15 phút trong bóng tối. Cuối quá trình, các phiến kính được rửa bằng nước cất để loại bỏ vết nhuộm thừa và sấy khô ở nhiệt độ phòng.
Ít nhất 1000 hồng cầu từ mỗi nòng nọc được phân tích bằng kính hiển vi 100× với vật kính 71 để xác định sự hiện diện của MN và ENA. Tổng cộng 75.796 hồng cầu từ nòng nọc được đánh giá khi xem xét nồng độ cypermethrin và đối chứng. Độc tính di truyền được phân tích theo phương pháp của Carrasco và cộng sự và Fenech và cộng sự38,72 bằng cách xác định tần suất các tổn thương nhân sau: (1) tế bào không nhân: tế bào không có nhân; (2) tế bào chết theo chương trình: phân mảnh nhân, chết tế bào theo chương trình; (3) tế bào hai nhân: tế bào có hai nhân; (4) chồi nhân hoặc tế bào phồng: tế bào có nhân với các phần lồi nhỏ của màng nhân, các phồng có kích thước tương tự như vi nhân; (5) tế bào nhân phân giải: tế bào chỉ có đường viền của nhân mà không có vật liệu bên trong; (6) tế bào khía: tế bào có nhân có các vết nứt hoặc khía rõ ràng trên hình dạng của chúng, còn gọi là nhân hình quả thận; (7) tế bào thùy: tế bào có phần lồi nhân lớn hơn các túi đã đề cập ở trên; và (8) tế bào vi mô: tế bào có nhân cô đặc và tế bào chất giảm. Những thay đổi này được so sánh với kết quả đối chứng âm tính.
Kết quả thử nghiệm độc tính cấp tính (LC50) được phân tích bằng phần mềm GBasic và phương pháp TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Dữ liệu thử nghiệm mạn tính được kiểm tra trước về tính chuẩn sai số (Shapiro-Wilks) và tính đồng nhất phương sai (Bartlett). Kết quả được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA). Kiểm định Tukey được sử dụng để so sánh dữ liệu giữa các nhóm, và kiểm định Dunnett được sử dụng để so sánh dữ liệu giữa nhóm điều trị và nhóm đối chứng âm tính.
Dữ liệu LOEC và NOEC được phân tích bằng kiểm định Dunnett. Các kiểm định thống kê được thực hiện bằng phần mềm Statistica 8.0 (StatSoft) với mức ý nghĩa 95% (p < 0,05).
Thời gian đăng: 13-03-2025