Sự phát triển của mô phân sinh đỉnh chồi (SAM) rất quan trọng đối với cấu trúc thân cây. Hormone thực vậtgibberellin(GA) đóng vai trò quan trọng trong việc điều phối sự phát triển của thực vật, nhưng vai trò của chúng trong SAM vẫn chưa được hiểu rõ. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một cảm biến sinh học tỷ lệ của tín hiệu GA bằng cách thiết kế protein DELLA để ức chế chức năng điều hòa thiết yếu của nó trong phản ứng phiên mã GA trong khi vẫn bảo toàn sự phân hủy của nó khi nhận dạng GA. Chúng tôi chứng minh rằng cảm biến sinh học dựa trên sự phân hủy này ghi lại chính xác những thay đổi về mức GA và cảm biến tế bào trong quá trình phát triển. Chúng tôi đã sử dụng cảm biến sinh học này để lập bản đồ hoạt động truyền tín hiệu GA trong SAM. Chúng tôi chỉ ra rằng tín hiệu GA cao chủ yếu có trong các tế bào nằm giữa các nguyên thủy cơ quan, là tiền thân của các tế bào đốt. Sử dụng các phương pháp tăng và mất chức năng, chúng tôi tiếp tục chứng minh rằng GA điều chỉnh hướng của mặt phẳng phân chia tế bào, thiết lập tổ chức tế bào chuẩn của các đốt, do đó thúc đẩy quá trình xác định đốt trong SAM.
Mô phân sinh đỉnh chồi (SAM), nằm ở đỉnh chồi, chứa một hốc tế bào gốc có hoạt động tạo ra các cơ quan bên và các đốt thân theo cách mô-đun và lặp đi lặp lại trong suốt vòng đời của cây. Mỗi đơn vị lặp lại này, hoặc các đốt thực vật, bao gồm các đốt và các cơ quan bên tại các đốt và mô phân sinh nách ở nách lá1. Sự phát triển và tổ chức của các đốt thực vật thay đổi trong quá trình phát triển. Ở Arabidopsis, sự phát triển của các đốt bị ức chế trong giai đoạn sinh dưỡng và các mô phân sinh nách vẫn ở trạng thái ngủ đông ở nách lá hình hoa thị. Trong quá trình chuyển đổi sang giai đoạn ra hoa, SAM trở thành mô phân sinh cụm hoa, tạo ra các đốt và chồi nách dài, các nhánh ở nách lá thân và sau đó là các hoa không lá2. Mặc dù chúng ta đã đạt được tiến bộ đáng kể trong việc hiểu các cơ chế kiểm soát sự khởi đầu của lá, hoa và cành, nhưng chúng ta biết tương đối ít về cách các đốt xuất hiện.
Hiểu được sự phân bố không gian-thời gian của GA sẽ giúp hiểu rõ hơn về chức năng của các hormone này trong các mô khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Hình ảnh trực quan về sự thoái hóa của hợp nhất RGA-GFP được thể hiện dưới tác động của chính chất xúc tác của nó cung cấp thông tin quan trọng về việc điều chỉnh nồng độ GA tổng thể trong rễ15,16. Tuy nhiên, biểu hiện RGA thay đổi giữa các mô17 và được điều chỉnh bởi GA18. Do đó, biểu hiện khác biệt của chất xúc tác RGA có thể dẫn đến kiểu huỳnh quang được quan sát thấy với RGA-GFP và do đó phương pháp này không phải là định lượng. Gần đây hơn, GA19,20 được gắn nhãn bằng fluorescein (Fl) hoạt tính sinh học đã tiết lộ sự tích tụ GA trong nội vỏ rễ và sự điều chỉnh mức độ tế bào của nó bằng cách vận chuyển GA. Gần đây, cảm biến GA FRET nlsGPS1 cho thấy mức GA tương quan với sự kéo dài tế bào ở rễ, sợi và hạ mầm phát triển tối21. Tuy nhiên, như chúng ta đã thấy, nồng độ GA không phải là thông số duy nhất kiểm soát hoạt động truyền tín hiệu GA, vì nó phụ thuộc vào các quá trình cảm biến phức tạp. Ở đây, dựa trên hiểu biết của chúng tôi về các con đường truyền tín hiệu DELLA và GA, chúng tôi báo cáo về sự phát triển và đặc tính của một cảm biến sinh học tỷ lệ dựa trên sự thoái hóa cho tín hiệu GA. Để phát triển cảm biến sinh học định lượng này, chúng tôi đã sử dụng một RGA đột biến nhạy cảm với GA được hợp nhất với một protein huỳnh quang và được biểu hiện phổ biến trong các mô, cũng như một protein huỳnh quang không nhạy cảm với GA. Chúng tôi chứng minh rằng các hợp nhất protein RGA đột biến không can thiệp vào tín hiệu GA nội sinh khi được biểu hiện phổ biến và cảm biến sinh học này có thể định lượng hoạt động truyền tín hiệu phát sinh từ cả đầu vào GA và quá trình xử lý tín hiệu GA của bộ máy cảm biến với độ phân giải không gian thời gian cao. Chúng tôi đã sử dụng cảm biến sinh học này để lập bản đồ phân bố không gian thời gian của hoạt động truyền tín hiệu GA và định lượng cách GA điều chỉnh hành vi tế bào trong biểu bì SAM. Chúng tôi chứng minh rằng GA điều chỉnh hướng của mặt phẳng phân chia của các tế bào SAM nằm giữa các nguyên thủy của cơ quan, do đó xác định tổ chức tế bào chính thống của đốt.
Cuối cùng, chúng tôi đã hỏi liệu qmRGA có thể báo cáo những thay đổi về mức GA nội sinh bằng cách sử dụng hypocotyl đang phát triển hay không. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng nitrat kích thích sự phát triển bằng cách tăng tổng hợp GA và đến lượt nó, sự phân hủy DELLA34. Theo đó, chúng tôi quan sát thấy chiều dài hypocotyl ở cây con pUBQ10::qmRGA được trồng trong điều kiện cung cấp nitrat dồi dào (10 mM NO3−) dài hơn đáng kể so với cây con được trồng trong điều kiện thiếu nitrat (Hình bổ sung 6a). Phù hợp với phản ứng tăng trưởng, tín hiệu GA cao hơn ở hypocotyl của cây con được trồng trong điều kiện 10 mM NO3− so với cây con được trồng trong điều kiện không có nitrat (Hình bổ sung 6b, c). Do đó, qmRGA cũng cho phép theo dõi những thay đổi trong tín hiệu GA do những thay đổi nội sinh về nồng độ GA gây ra.
Để hiểu liệu hoạt động truyền tín hiệu GA được qmRGA phát hiện có phụ thuộc vào nồng độ GA và nhận thức GA hay không, như mong đợi dựa trên thiết kế cảm biến, chúng tôi đã phân tích biểu hiện của ba thụ thể GID1 trong mô sinh dưỡng và sinh sản. Ở cây con, dòng phóng viên GID1-GUS cho thấy GID1a và c được biểu hiện cao ở lá mầm (Hình 3a–c). Ngoài ra, cả ba thụ thể đều được biểu hiện ở lá, nguyên sinh rễ bên, đầu rễ (trừ chóp rễ của GID1b) và hệ thống mạch (Hình 3a–c). Trong SAM cụm hoa, chúng tôi chỉ phát hiện tín hiệu GUS đối với GID1b và 1c (Hình bổ sung 7a–c). Lai tạo in situ đã xác nhận các kiểu biểu hiện này và chứng minh thêm rằng GID1c được biểu hiện đồng đều ở mức thấp trong SAM, trong khi GID1b biểu hiện cao hơn ở ngoại vi của SAM (Hình bổ sung 7d–l). Sự hợp nhất dịch mã pGID1b::2xmTQ2-GID1b cũng cho thấy một phạm vi biểu hiện GID1b được phân loại, từ biểu hiện thấp hoặc không biểu hiện ở trung tâm của SAM đến biểu hiện cao ở ranh giới cơ quan (Hình bổ sung 7m). Do đó, các thụ thể GID1 không được phân bố đồng đều trên và trong các mô. Trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi cũng quan sát thấy rằng sự biểu hiện quá mức của GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) làm tăng độ nhạy của qmRGA ở hạ mầm đối với ứng dụng GA bên ngoài (Hình 3d, e). Ngược lại, huỳnh quang được đo bằng qd17mRGA ở hạ mầm không nhạy cảm với xử lý GA3 (Hình 3f, g). Đối với cả hai xét nghiệm, cây con được xử lý bằng nồng độ GA cao (100 μM GA3) để đánh giá hành vi nhanh của cảm biến, trong đó khả năng liên kết với thụ thể GID1 được tăng cường hoặc mất đi. Những kết quả này cùng nhau xác nhận rằng cảm biến sinh học qmRGA có chức năng kết hợp như cảm biến GA và GA, và cho thấy rằng sự biểu hiện khác biệt của thụ thể GID1 có thể điều chỉnh đáng kể độ phát xạ của cảm biến.
Cho đến nay, sự phân bố tín hiệu GA trong SAM vẫn chưa rõ ràng. Do đó, chúng tôi đã sử dụng thực vật biểu hiện qmRGA và tế bào gốc báo cáo pCLV3::mCherry-NLS35 để tính toán bản đồ định lượng độ phân giải cao về hoạt động truyền tín hiệu GA, tập trung vào lớp L1 (biểu bì; Hình 4a, b, xem Phương pháp và Phương pháp bổ sung), vì L1 đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của SAM36. Ở đây, biểu hiện pCLV3::mCherry-NLS cung cấp một điểm tham chiếu hình học cố định để phân tích sự phân bố không gian-thời gian của hoạt động truyền tín hiệu GA37. Mặc dù GA được coi là cần thiết cho sự phát triển của cơ quan bên4, chúng tôi quan sát thấy rằng tín hiệu GA thấp ở nguyên mẫu hoa (P) bắt đầu từ giai đoạn P3 (Hình 4a, b), trong khi nguyên mẫu P1 và P2 non có hoạt động vừa phải tương tự như ở vùng trung tâm (Hình 4a, b). Hoạt động truyền tín hiệu GA cao hơn được phát hiện tại ranh giới nguyên thủy của cơ quan, bắt đầu từ P1/P2 (ở hai bên ranh giới) và đạt đỉnh tại P4, cũng như trong tất cả các tế bào của vùng ngoại vi nằm giữa nguyên thủy (Hình 4a, b và Hình bổ sung 8a, b). Hoạt động truyền tín hiệu GA cao hơn này không chỉ được quan sát thấy ở lớp biểu bì mà còn ở lớp L2 và lớp L3 phía trên (Hình bổ sung 8b). Mẫu tín hiệu GA được phát hiện trong SAM bằng cách sử dụng qmRGA cũng không thay đổi theo thời gian (Hình bổ sung 8c–f, k). Mặc dù cấu trúc qd17mRGA bị giảm một cách có hệ thống trong SAM của cây T3 từ năm dòng độc lập mà chúng tôi đã mô tả chi tiết, chúng tôi vẫn có thể phân tích các mẫu huỳnh quang thu được bằng cấu trúc pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Hình bổ sung 8g–j, l). Trong dòng kiểm soát này, chỉ có những thay đổi nhỏ trong tỷ lệ huỳnh quang được phát hiện trong SAM, nhưng ở trung tâm SAM, chúng tôi quan sát thấy sự giảm rõ ràng và bất ngờ trong VENUS liên quan đến TagBFP. Điều này xác nhận rằng mô hình tín hiệu được quan sát bởi qmRGA phản ánh sự thoái hóa phụ thuộc GA của mRGA-VENUS, nhưng cũng chứng minh rằng qmRGA có thể đánh giá quá cao hoạt động tín hiệu GA ở trung tâm mô phân sinh. Tóm lại, kết quả của chúng tôi cho thấy mô hình tín hiệu GA chủ yếu phản ánh sự phân bố của nguyên mẫu. Sự phân bố này của vùng liên nguyên mẫu (IPR) là do sự thiết lập dần dần hoạt động tín hiệu GA cao giữa nguyên mẫu đang phát triển và vùng trung tâm, trong khi cùng lúc đó hoạt động tín hiệu GA trong nguyên mẫu giảm (Hình 4c, d).
Sự phân bố của các thụ thể GID1b và GID1c (xem ở trên) cho thấy rằng sự biểu hiện khác biệt của các thụ thể GA giúp định hình mô hình hoạt động truyền tín hiệu GA trong SAM. Chúng tôi tự hỏi liệu sự tích tụ khác biệt của GA có liên quan hay không. Để nghiên cứu khả năng này, chúng tôi đã sử dụng cảm biến nlsGPS1 GA FRET21. Tần suất hoạt hóa tăng lên đã được phát hiện trong SAM của nlsGPS1 được xử lý bằng 10 μM GA4+7 trong 100 phút (Hình bổ sung 9a–e), cho thấy nlsGPS1 phản ứng với những thay đổi về nồng độ GA trong SAM, giống như ở rễ21. Sự phân bố không gian của tần suất hoạt hóa nlsGPS1 cho thấy mức GA tương đối thấp ở các lớp ngoài của SAM, nhưng cho thấy rằng chúng tăng cao ở trung tâm và tại các ranh giới của SAM (Hình 4e và Hình bổ sung 9a,c). Điều này cho thấy rằng GA cũng được phân bố trong SAM với mô hình không gian tương đương với mô hình được tiết lộ bởi qmRGA. Là một phương pháp bổ sung, chúng tôi cũng xử lý SAM bằng GA huỳnh quang (GA3-, GA4-, GA7-Fl) hoặc Fl riêng lẻ như một đối chứng âm tính. Tín hiệu Fl được phân phối khắp SAM, bao gồm vùng trung tâm và nguyên thủy, mặc dù ở cường độ thấp hơn (Hình 4j và Hình bổ sung 10d). Ngược lại, cả ba GA-Fl đều tích tụ cụ thể trong các ranh giới nguyên thủy và ở các mức độ khác nhau trong phần còn lại của IPR, với GA7-Fl tích tụ trong miền lớn nhất trong IPR (Hình 4k và Hình bổ sung 10a, b). Định lượng cường độ huỳnh quang cho thấy tỷ lệ cường độ IPR so với cường độ không phải IPR cao hơn ở SAM được xử lý bằng GA-Fl so với SAM được xử lý bằng Fl (Hình 4l và Hình bổ sung 10c). Cùng nhau, những kết quả này cho thấy GA có mặt ở nồng độ cao hơn trong các tế bào IPR nằm gần ranh giới cơ quan nhất. Điều này cho thấy rằng mô hình hoạt động truyền tín hiệu GA của SAM là kết quả của cả biểu hiện khác biệt của thụ thể GA và sự tích tụ khác biệt của GA trong các tế bào IPR gần ranh giới cơ quan. Do đó, phân tích của chúng tôi đã tiết lộ một mô hình không gian thời gian bất ngờ của truyền tín hiệu GA, với hoạt động thấp hơn ở trung tâm và nguyên thủy của SAM và hoạt động cao hơn ở IPR ở vùng ngoại vi.
Để hiểu vai trò của hoạt động truyền tín hiệu GA khác biệt trong SAM, chúng tôi đã phân tích mối tương quan giữa hoạt động truyền tín hiệu GA, sự mở rộng tế bào và sự phân chia tế bào bằng cách sử dụng hình ảnh chụp theo thời gian thực của SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Với vai trò của GA trong điều hòa tăng trưởng, người ta mong đợi có mối tương quan dương với các thông số mở rộng tế bào. Do đó, trước tiên chúng tôi so sánh bản đồ hoạt động truyền tín hiệu GA với bản đồ tốc độ tăng trưởng bề mặt tế bào (như một đại diện cho cường độ mở rộng tế bào đối với một tế bào nhất định và đối với các tế bào con khi phân chia) và với bản đồ dị hướng tăng trưởng, đo hướng mở rộng tế bào (cũng được sử dụng ở đây cho một tế bào nhất định và đối với các tế bào con khi phân chia; Hình 5a, b, xem Phương pháp và Phương pháp bổ sung). Bản đồ tốc độ tăng trưởng bề mặt tế bào SAM của chúng tôi phù hợp với các quan sát trước đây38,39, với tốc độ tăng trưởng tối thiểu ở ranh giới và tốc độ tăng trưởng tối đa ở các hoa đang phát triển (Hình 5a). Phân tích thành phần chính (PCA) cho thấy hoạt động truyền tín hiệu GA có mối tương quan âm với cường độ tăng trưởng bề mặt tế bào (Hình 5c). Chúng tôi cũng chỉ ra rằng các trục biến thiên chính, bao gồm đầu vào tín hiệu GA và cường độ tăng trưởng, vuông góc với hướng xác định bởi biểu hiện CLV3 cao, xác nhận việc loại trừ các tế bào khỏi trung tâm SAM trong các phân tích còn lại. Phân tích tương quan Spearman đã xác nhận kết quả PCA (Hình 5d), chỉ ra rằng tín hiệu GA cao hơn trong IPR không dẫn đến sự mở rộng tế bào cao hơn. Tuy nhiên, phân tích tương quan cho thấy có mối tương quan dương nhẹ giữa hoạt động tín hiệu GA và tính dị hướng tăng trưởng (Hình 5c, d), cho thấy tín hiệu GA cao hơn trong IPR ảnh hưởng đến hướng tăng trưởng tế bào và có thể là vị trí của mặt phẳng phân chia tế bào.
a, b Bản đồ nhiệt về sự tăng trưởng bề mặt trung bình (a) và tính dị hướng tăng trưởng (b) trong SAM được tính trung bình trên bảy cây độc lập (lần lượt được sử dụng làm đại diện cho cường độ và hướng mở rộng tế bào). c Phân tích PCA bao gồm các biến sau: tín hiệu GA, cường độ tăng trưởng bề mặt, tính dị hướng tăng trưởng bề mặt và biểu hiện CLV3. Thành phần PCA 1 chủ yếu có tương quan âm với cường độ tăng trưởng bề mặt và tương quan dương với tín hiệu GA. Thành phần PCA 2 chủ yếu có tương quan dương với tính dị hướng tăng trưởng bề mặt và tương quan âm với biểu hiện CLV3. Phần trăm biểu thị sự thay đổi được giải thích bởi từng thành phần. d Phân tích tương quan Spearman giữa tín hiệu GA, cường độ tăng trưởng bề mặt và tính dị hướng tăng trưởng bề mặt ở quy mô mô không bao gồm CZ. Con số bên phải là giá trị Spearman rho giữa hai biến. Dấu hoa thị chỉ ra những trường hợp mà tương quan/tương quan âm có ý nghĩa cao. e Hình ảnh 3D của tế bào Col-0 SAM L1 bằng kính hiển vi cộng hưởng. Các thành tế bào mới hình thành trong SAM (nhưng không phải nguyên sinh) ở thời điểm 10 giờ được tô màu theo giá trị góc của chúng. Thanh màu được hiển thị ở góc dưới bên phải. Hình chèn hiển thị hình ảnh 3D tương ứng ở thời điểm 0 giờ. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. f Biểu đồ hộp hiển thị tốc độ phân chia tế bào trong SAM Col-0 có IPR và không có IPR (n = 10 cây độc lập). Đường trung tâm hiển thị giá trị trung vị và ranh giới hộp biểu thị phần trăm thứ 25 và thứ 75. Râu biểu thị giá trị tối thiểu và tối đa xác định bằng phần mềm R. Giá trị P thu được bằng kiểm định t hai đuôi của Welch. g, h Sơ đồ minh họa cho thấy (g) cách đo góc của thành tế bào mới (màu đỏ tươi) so với hướng xuyên tâm từ tâm của SAM (đường chấm trắng) (chỉ xem xét các giá trị góc nhọn, tức là 0–90°), và (h) hướng chu vi/bên và hướng xuyên tâm trong mô phân sinh. i Biểu đồ tần suất của hướng mặt phẳng phân chia tế bào trên SAM (xanh đậm), IPR (xanh vừa) và không phải IPR (xanh nhạt), tương ứng. Giá trị P thu được bằng kiểm định Kolmogorov-Smirnov hai đuôi. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. j Biểu đồ tần suất của hướng mặt phẳng phân chia tế bào của IPR quanh P3 (xanh nhạt), P4 (xanh vừa) và P5 (xanh đậm), tương ứng. Giá trị P thu được bằng kiểm định Kolmogorov-Smirnov hai đuôi. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự.
Do đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu mối tương quan giữa tín hiệu GA và hoạt động phân chia tế bào bằng cách xác định các thành tế bào mới hình thành trong quá trình thử nghiệm (Hình 5e). Phương pháp này cho phép chúng tôi đo tần suất và hướng phân chia tế bào. Đáng ngạc nhiên là chúng tôi thấy rằng tần suất phân chia tế bào trong IPR và phần còn lại của SAM (không phải IPR, Hình 5f) là tương tự nhau, cho thấy sự khác biệt trong tín hiệu GA giữa các tế bào IPR và không phải IPR không ảnh hưởng đáng kể đến sự phân chia tế bào. Điều này, cùng với mối tương quan tích cực giữa tín hiệu GA và tính dị hướng tăng trưởng, đã thúc đẩy chúng tôi xem xét liệu hoạt động tín hiệu GA có thể ảnh hưởng đến hướng của mặt phẳng phân chia tế bào hay không. Chúng tôi đã đo hướng của thành tế bào mới theo góc nhọn so với trục xuyên tâm nối tâm mô phân sinh và tâm của thành tế bào mới (Hình 5e-i) và quan sát thấy xu hướng rõ ràng là các tế bào phân chia ở các góc gần 90° so với trục xuyên tâm, với tần suất cao nhất được quan sát thấy ở 70–80° (23,28%) và 80–90° (22,62%) (Hình 5e,i), tương ứng với các phân chia tế bào theo hướng chu vi/ngang (Hình 5h). Để kiểm tra sự đóng góp của tín hiệu GA vào hành vi phân chia tế bào này, chúng tôi đã phân tích các thông số phân chia tế bào trong IPR và không phải IPR riêng biệt (Hình 5i). Chúng tôi quan sát thấy sự phân bố góc phân chia trong các tế bào IPR khác với các tế bào không có IPR hoặc trong các tế bào trong toàn bộ SAM, với các tế bào IPR biểu hiện tỷ lệ phân chia tế bào theo chiều ngang/tròn cao hơn, tức là 70–80° và 80–90° (lần lượt là 33,86% và 30,71%, tỷ lệ tương ứng) (Hình 5i). Do đó, quan sát của chúng tôi cho thấy mối liên hệ giữa tín hiệu GA cao và hướng mặt phẳng phân chia tế bào gần với hướng chu vi, tương tự như mối tương quan giữa hoạt động tín hiệu GA và tính dị hướng tăng trưởng (Hình 5c, d). Để thiết lập thêm tính bảo toàn không gian của mối liên hệ này, chúng tôi đã đo hướng mặt phẳng phân chia trong các tế bào IPR xung quanh nguyên phân bắt đầu từ P3, vì hoạt động tín hiệu GA cao nhất được phát hiện ở vùng này bắt đầu từ P4 (Hình 4). Góc phân chia của IPR quanh P3 và P4 không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, mặc dù tần suất phân chia tế bào theo chiều ngang tăng lên được quan sát thấy ở IPR quanh P4 (Hình 5j). Tuy nhiên, trong các tế bào IPR xung quanh P5, sự khác biệt về hướng của mặt phẳng phân chia tế bào trở nên có ý nghĩa thống kê, với sự gia tăng mạnh về tần suất phân chia tế bào ngang (Hình 5j). Cùng nhau, những kết quả này cho thấy tín hiệu GA có thể kiểm soát hướng phân chia tế bào trong SAM, điều này phù hợp với các báo cáo trước đây40,41 rằng tín hiệu GA cao có thể gây ra hướng phân chia tế bào theo chiều ngang trong IPR.
Người ta dự đoán rằng các tế bào trong IPR sẽ không được đưa vào nguyên thủy mà vào các đốt2,42,43. Định hướng ngang của các phân chia tế bào trong IPR có thể dẫn đến tổ chức điển hình của các hàng tế bào biểu bì song song theo chiều dọc trong các đốt. Các quan sát của chúng tôi được mô tả ở trên cho thấy rằng tín hiệu GA có thể đóng một vai trò trong quá trình này bằng cách điều chỉnh hướng phân chia tế bào.
Việc mất chức năng của một số gen DELLA dẫn đến phản ứng GA cấu thành và các đột biến della có thể được sử dụng để kiểm tra giả thuyết này44. Đầu tiên, chúng tôi đã phân tích các kiểu biểu hiện của năm gen DELLA trong SAM. Sự hợp nhất phiên mã của dòng GUS45 cho thấy GAI, RGA, RGL1 và RGL2 (ở mức độ ít hơn nhiều) được biểu hiện trong SAM (Hình bổ sung 11a–d). Lai tạo tại chỗ tiếp tục chứng minh rằng mRNA GAI tích tụ cụ thể ở nguyên thủy và hoa đang phát triển (Hình bổ sung 11e). mRNA RGL1 và RGL3 được phát hiện trên khắp tán SAM và ở những bông hoa già hơn, trong khi mRNA RGL2 có nhiều hơn ở vùng biên (Hình bổ sung 11f–h). Hình ảnh cộng hưởng của pRGL3::RGL3-GFP SAM đã xác nhận biểu hiện được quan sát thấy bằng lai tạo tại chỗ và cho thấy protein RGL3 tích tụ ở phần trung tâm của SAM (Hình bổ sung 11i). Sử dụng dòng pRGA::GFP-RGA, chúng tôi cũng phát hiện ra rằng protein RGA tích tụ trong SAM, nhưng sự phong phú của nó giảm dần ở ranh giới bắt đầu từ P4 (Hình bổ sung 11j). Đáng chú ý là các kiểu biểu hiện của RGL3 và RGA phù hợp với hoạt động truyền tín hiệu GA cao hơn trong IPR, như được phát hiện bởi qmRGA (Hình 4). Hơn nữa, các dữ liệu này chỉ ra rằng tất cả các DELLA đều được biểu hiện trong SAM và biểu hiện của chúng tập thể trải dài toàn bộ SAM.
Tiếp theo, chúng tôi phân tích các thông số phân chia tế bào trong SAM kiểu hoang dã (Ler, đối chứng) và đột biến gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (toàn cầu) (Hình 6a, b). Điều thú vị là chúng tôi đã quan sát thấy sự thay đổi có ý nghĩa thống kê trong phân bố tần suất góc phân chia tế bào trong SAM đột biến della global so với kiểu hoang dã (Hình 6c). Sự thay đổi này ở đột biến della global là do sự gia tăng tần suất góc 80–90° (34,71% so với 24,55%) và ở mức độ thấp hơn là góc 70–80° (23,78% so với 20,18%), tức là tương ứng với phân chia tế bào theo chiều ngang (Hình 6c). Tần suất phân chia không theo chiều ngang (0–60°) cũng thấp hơn ở đột biến della global (Hình 6c). Tần suất phân chia tế bào ngang tăng đáng kể trong SAM của đột biến toàn cục della (Hình 6b). Tần suất phân chia tế bào ngang trong IPR cũng cao hơn ở đột biến toàn cục della so với kiểu hoang dã (Hình 6d). Bên ngoài vùng IPR, kiểu hoang dã có sự phân bố góc phân chia tế bào đồng đều hơn, trong khi đột biến toàn cục della ưa thích các phân chia tiếp tuyến như IPR (Hình 6e). Chúng tôi cũng định lượng hướng phân chia tế bào trong SAM của đột biến năm nhóm ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 và ga2ox6-2), một nền tảng đột biến không hoạt động với GA trong đó GA tích tụ. Phù hợp với sự gia tăng nồng độ GA, SAM của cụm hoa đột biến ga2ox ngũ bội lớn hơn cụm hoa đột biến Col-0 (Hình bổ sung 12a, b) và so với Col-0, SAM ga2ox ngũ bội cho thấy sự phân bố góc phân chia tế bào khác biệt rõ rệt, với tần số góc tăng từ 50° đến 90°, tức là một lần nữa ủng hộ phân chia tiếp tuyến (Hình bổ sung 12a–c). Do đó, chúng tôi chỉ ra rằng sự kích hoạt cấu thành của tín hiệu GA và sự tích tụ GA gây ra phân chia tế bào bên trong IPR và phần còn lại của SAM.
a, b Hình ảnh trực quan 3D của lớp L1 của Ler nhuộm PI (a) và đột biến della toàn cục (b) SAM sử dụng kính hiển vi cộng tiêu. Các thành tế bào mới hình thành trong SAM (nhưng không phải nguyên thủy) trong khoảng thời gian 10 giờ được hiển thị và tô màu theo giá trị góc của chúng. Hình chèn cho thấy SAM ở 0 giờ. Thanh màu được hiển thị ở góc dưới bên phải. Mũi tên trong (b) trỏ đến một ví dụ về các tệp tế bào được căn chỉnh trong đột biến della toàn cục. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. ce so sánh tần suất phân bố của hướng mặt phẳng phân chia tế bào trong toàn bộ SAM (d), IPR (e) và không phải IPR (f) giữa Ler và della toàn cục. Giá trị P thu được bằng cách sử dụng kiểm định Kolmogorov-Smirnov hai đuôi. f, g Hình ảnh trực quan 3D của hình ảnh cộng tiêu của SAM nhuộm PI của cây chuyển gen Col-0 (i) và pCUC2::gai-1-VENUS (j). Các bảng (a, b) cho thấy các thành tế bào mới (nhưng không phải là nguyên thủy) được hình thành trong SAM trong vòng 10 giờ. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. h–j So sánh phân bố tần suất của các hướng mặt phẳng phân chia tế bào nằm trong toàn bộ SAM (h), IPR (i) và không phải IPR (j) giữa các cây Col-0 và pCUC2::gai-1-VENUS. Giá trị P thu được bằng cách sử dụng kiểm định Kolmogorov–Smirnov hai đuôi.
Tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm tác dụng ức chế tín hiệu GA cụ thể trong IPR. Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã sử dụng promoter cốc lá mầm 2 (CUC2) để thúc đẩy biểu hiện của protein gai-1 âm tính trội được hợp nhất với VENUS (trong dòng pCUC2::gai-1-VENUS). Trong SAM kiểu hoang dã, promoter CUC2 thúc đẩy biểu hiện của hầu hết các IPR trong SAM, bao gồm các tế bào viền, từ P4 trở đi và biểu hiện đặc hiệu tương tự đã được quan sát thấy ở các cây pCUC2::gai-1-VENUS (xem bên dưới). Sự phân bố các góc phân chia tế bào trên SAM hoặc IPR của các cây pCUC2::gai-1-VENUS không khác biệt đáng kể so với kiểu hoang dã, mặc dù chúng tôi bất ngờ phát hiện ra rằng các tế bào không có IPR ở những cây này phân chia ở tần suất cao hơn là 80–90° (Hình 6f–j).
Người ta cho rằng hướng phân chia tế bào phụ thuộc vào hình dạng của SAM, đặc biệt là ứng suất kéo do độ cong của mô tạo ra46. Do đó, chúng tôi đã đặt câu hỏi liệu hình dạng của SAM có bị thay đổi ở cây đột biến toàn cục della và cây pCUC2::gai-1-VENUS hay không. Như đã báo cáo trước đó12, kích thước của SAM đột biến toàn cục della lớn hơn kích thước của kiểu hoang dã (Hình bổ sung 13a, b, d). Lai tạo in situ của CLV3 và RNA STM đã xác nhận sự mở rộng mô phân sinh ở cây đột biến della và cho thấy thêm sự mở rộng theo chiều ngang của hốc tế bào gốc (Hình bổ sung 13e, f, h, i). Tuy nhiên, độ cong của SAM tương tự nhau ở cả hai kiểu gen (Hình bổ sung 13k, m, n, p). Chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng kích thước tương tự ở đột biến tứ phân gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della mà không có sự thay đổi về độ cong so với kiểu hoang dã (Hình bổ sung 13c, d, g, j, l, o, p). Tần suất định hướng phân chia tế bào cũng bị ảnh hưởng ở đột biến tứ phân della, nhưng ở mức độ thấp hơn so với đột biến đơn khối della (Hình bổ sung 12d–f). Hiệu ứng liều lượng này, cùng với việc không có tác dụng lên độ cong, cho thấy hoạt động RGL3 còn lại ở đột biến tứ phân Della hạn chế những thay đổi về định hướng phân chia tế bào do mất hoạt động DELLA và những thay đổi trong phân chia tế bào bên xảy ra để đáp ứng với những thay đổi trong hoạt động truyền tín hiệu GA chứ không phải những thay đổi trong hình học SAM. Như đã mô tả ở trên, trình khởi động CUC2 thúc đẩy biểu hiện IPR trong SAM bắt đầu từ P4 (Hình bổ sung 14a, b) và ngược lại, pCUC2::gai-1-VENUS SAM có kích thước nhỏ hơn nhưng độ cong cao hơn (Hình bổ sung 14c–h). Sự thay đổi này trong hình thái pCUC2::gai-1-VENUS SAM có thể dẫn đến sự phân bố ứng suất cơ học khác so với kiểu hoang dã, trong đó ứng suất chu vi cao bắt đầu ở khoảng cách ngắn hơn từ trung tâm SAM47. Mặt khác, những thay đổi trong hình thái pCUC2::gai-1-VENUS SAM có thể là kết quả của những thay đổi trong các đặc tính cơ học khu vực do biểu hiện gen chuyển gây ra48. Trong cả hai trường hợp, điều này có thể bù đắp một phần tác động của những thay đổi trong tín hiệu GA bằng cách tăng khả năng các tế bào sẽ phân chia theo hướng chu vi/ngang, giải thích cho những quan sát của chúng tôi.
Tổng hợp lại, dữ liệu của chúng tôi xác nhận rằng tín hiệu GA cao hơn đóng vai trò tích cực trong định hướng bên của mặt phẳng phân chia tế bào trong IPR. Chúng cũng cho thấy độ cong của mô phân sinh cũng ảnh hưởng đến định hướng của mặt phẳng phân chia tế bào trong IPR.
Hướng ngang của mặt phẳng phân chia trong IPR, do hoạt động truyền tín hiệu GA cao, cho thấy GA sắp xếp trước một tệp tế bào hướng tâm trong lớp biểu bì trong SAM để xác định tổ chức tế bào sau này sẽ được tìm thấy trong đốt biểu bì. Thật vậy, các tệp tế bào như vậy thường thấy trong hình ảnh SAM của đột biến della global (Hình 6b). Do đó, để khám phá thêm chức năng phát triển của mô hình không gian truyền tín hiệu GA trong SAM, chúng tôi đã sử dụng hình ảnh chụp nhanh theo thời gian để phân tích tổ chức không gian của các tế bào trong IPR ở cây chuyển gen kiểu hoang dã (Ler và Col-0), đột biến della global và pCUC2::gai-1-VENUS.
Chúng tôi thấy rằng qmRGA cho thấy hoạt động truyền tín hiệu GA trong IPR tăng từ P1/P2 và đạt đỉnh tại P4, và kiểu mẫu này vẫn không đổi theo thời gian (Hình 4a–f và Hình bổ sung 8c–f, k). Để phân tích tổ chức không gian của các tế bào trong IPR với tín hiệu GA tăng, chúng tôi đã dán nhãn các tế bào IPR Ler ở trên và ở hai bên của P4 theo số phận phát triển của chúng được phân tích 34 giờ sau lần quan sát đầu tiên, tức là hơn hai thời gian plastid, cho phép chúng tôi theo dõi các tế bào IPR trong quá trình phát triển nguyên thủy từ P1/P2 đến P4. Chúng tôi đã sử dụng ba màu khác nhau: màu vàng cho những tế bào đã được tích hợp vào nguyên thủy gần P4, màu xanh lá cây cho những tế bào ở trong IPR và màu tím cho những tế bào tham gia vào cả hai quá trình (Hình 7a–c). Tại t0 (0 giờ), 1–2 lớp tế bào IPR có thể nhìn thấy ở phía trước P4 (Hình 7a). Như dự kiến, khi các tế bào này phân chia, chúng chủ yếu phân chia thông qua mặt phẳng phân chia ngang (Hình 7a–c). Các kết quả tương tự đã thu được khi sử dụng Col-0 SAM (tập trung vào P3, có đường viền gấp tương tự như P4 ở Ler), mặc dù ở kiểu gen này, nếp gấp hình thành ở đường viền hoa đã che giấu các tế bào IPR nhanh hơn (Hình 7g–i). Do đó, kiểu phân chia của các tế bào IPR sắp xếp trước các tế bào thành các hàng hướng tâm, như trong các đốt. Sự sắp xếp của các hàng hướng tâm và sự định vị của các tế bào IPR giữa các cơ quan kế tiếp cho thấy rằng các tế bào này là tiền thân của đốt.
Ở đây, chúng tôi đã phát triển một cảm biến sinh học truyền tín hiệu GA theo tỷ lệ, qmRGA, cho phép lập bản đồ định lượng hoạt động truyền tín hiệu GA phát sinh từ nồng độ GA và thụ thể GA kết hợp trong khi giảm thiểu sự can thiệp vào các con đường truyền tín hiệu nội sinh, do đó cung cấp thông tin về chức năng GA ở cấp độ tế bào. Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã xây dựng một protein DELLA đã được biến đổi, mRGA, đã mất khả năng liên kết với các đối tác tương tác DELLA nhưng vẫn nhạy cảm với quá trình phân giải do GA gây ra. qmRGA phản ứng với cả những thay đổi ngoại sinh và nội sinh ở mức GA, và các đặc tính cảm biến động của nó cho phép đánh giá những thay đổi không gian-thời gian trong hoạt động truyền tín hiệu GA trong quá trình phát triển. qmRGA cũng là một công cụ rất linh hoạt vì nó có thể được điều chỉnh cho các mô khác nhau bằng cách thay đổi trình tự khởi động được sử dụng để biểu hiện nó (nếu cần) và do bản chất bảo tồn của con đường truyền tín hiệu GA và mô típ PFYRE trên khắp các loài thực vật hạt kín, nên nó có khả năng có thể chuyển giao cho các loài khác22. Phù hợp với điều này, một đột biến tương đương trong protein SLR1 DELLA của lúa (HYY497AAA) cũng được chứng minh là ức chế hoạt động ức chế tăng trưởng của SLR1 trong khi chỉ làm giảm nhẹ quá trình phân hủy do GA trung gian, tương tự như mRGA23. Đáng chú ý, các nghiên cứu gần đây trên Arabidopsis cho thấy một đột biến axit amin đơn lẻ trong miền PFYRE (S474L) đã làm thay đổi hoạt động phiên mã của RGA mà không ảnh hưởng đến khả năng tương tác của nó với các đối tác yếu tố phiên mã50. Mặc dù đột biến này rất gần với 3 sự thay thế axit amin có trong mRGA, các nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng hai đột biến này làm thay đổi các đặc điểm riêng biệt của DELLA. Mặc dù hầu hết các đối tác yếu tố phiên mã liên kết với miền LHR1 và SAW của DELLA26,51, một số axit amin được bảo tồn trong miền PFYRE có thể giúp ổn định các tương tác này.
Sự phát triển lóng là một đặc điểm quan trọng trong kiến trúc thực vật và cải thiện năng suất. qmRGA cho thấy hoạt động truyền tín hiệu GA cao hơn trong các tế bào tiền thân lóng IPR. Bằng cách kết hợp hình ảnh định lượng và di truyền học, chúng tôi đã chỉ ra rằng các kiểu truyền tín hiệu GA chồng lên các mặt phẳng phân chia tế bào tròn/ngang trong biểu bì SAM, định hình tổ chức phân chia tế bào cần thiết cho sự phát triển lóng. Một số cơ quan điều hòa hướng mặt phẳng phân chia tế bào đã được xác định trong quá trình phát triển52,53. Công trình của chúng tôi cung cấp một ví dụ rõ ràng về cách hoạt động truyền tín hiệu GA điều hòa thông số tế bào này. DELLA có thể tương tác với các phức hợp protein gấp trước41, do đó truyền tín hiệu GA có thể điều hòa hướng mặt phẳng phân chia tế bào bằng cách ảnh hưởng trực tiếp đến hướng vi ống vỏ40,41,54,55. Chúng tôi bất ngờ chỉ ra rằng trong SAM, mối tương quan của hoạt động truyền tín hiệu GA cao hơn không phải là sự kéo dài hoặc phân chia tế bào, mà chỉ là tính dị hướng tăng trưởng, phù hợp với tác động trực tiếp của GA lên hướng phân chia tế bào trong IPR. Tuy nhiên, chúng ta không thể loại trừ rằng hiệu ứng này cũng có thể là gián tiếp, ví dụ như được trung gian bởi sự mềm hóa thành tế bào do GA gây ra56. Những thay đổi trong các đặc tính của thành tế bào gây ra ứng suất cơ học57,58, điều này cũng có thể ảnh hưởng đến hướng của mặt phẳng phân chia tế bào bằng cách ảnh hưởng đến hướng của các vi ống vỏ não39,46,59. Các hiệu ứng kết hợp của ứng suất cơ học do GA gây ra và sự điều hòa trực tiếp hướng của vi ống bởi GA có thể liên quan đến việc tạo ra một kiểu định hướng phân chia tế bào cụ thể trong IPR để xác định các đốt, và cần có thêm các nghiên cứu để kiểm tra ý tưởng này. Tương tự như vậy, các nghiên cứu trước đây đã làm nổi bật tầm quan trọng của các protein tương tác với DELLA là TCP14 và 15 trong việc kiểm soát sự hình thành đốt60,61 và các yếu tố này có thể trung gian cho hoạt động của GA cùng với BREVIPEDICELLUS (BP) và PENNYWISE (PNY), điều chỉnh sự phát triển của đốt và đã được chứng minh là ảnh hưởng đến tín hiệu GA2,62. Do DELLA tương tác với các con đường truyền tín hiệu brassinosteroid, ethylene, axit jasmonic và axit abscisic (ABA)63,64 và các hormone này có thể ảnh hưởng đến định hướng vi ống65, nên tác động của GA đối với định hướng phân chia tế bào cũng có thể được trung gian bởi các hormone khác.
Các nghiên cứu tế bào học ban đầu cho thấy cả vùng bên trong và bên ngoài của SAM Arabidopsis đều cần thiết cho sự phát triển lóng2,42. Thực tế là GA chủ động điều chỉnh sự phân chia tế bào ở các mô bên trong12 hỗ trợ chức năng kép của GA trong việc điều chỉnh kích thước mô phân sinh và lóng ở SAM. Mô hình phân chia tế bào theo hướng cũng được điều chỉnh chặt chẽ trong mô SAM bên trong và sự điều chỉnh này rất cần thiết cho sự phát triển của thân cây52. Sẽ rất thú vị khi xem xét liệu GA cũng đóng vai trò trong việc định hướng mặt phẳng phân chia tế bào trong tổ chức SAM bên trong hay không, do đó đồng bộ hóa sự chỉ định và phát triển của lóng bên trong SAM.
Cây được trồng trong ống nghiệm trong đất hoặc môi trường Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) bổ sung 1% sucrose và 1% agar (Sigma) trong điều kiện tiêu chuẩn (ánh sáng 16 giờ, 22 °C), ngoại trừ các thí nghiệm tăng trưởng hypocotyl và rễ trong đó cây con được trồng trên các đĩa thẳng đứng dưới ánh sáng liên tục và 22 °C. Đối với các thí nghiệm nitrat, cây được trồng trên môi trường MS đã biến đổi (môi trường thực vật bioWORLD) bổ sung đủ nitrat (0 hoặc 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, 1% sucrose và 1% A-agar (Sigma) trong điều kiện ngày dài.
CDNA GID1a được chèn vào pDONR221 được tái tổ hợp với pDONR P4-P1R-pUBQ10 và pDONR P2R-P3-mCherry vào pB7m34GW để tạo ra pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 được chèn vào pDONR221 được tái tổ hợp vào pB7RWG266 để tạo ra p35S:IDD2-RFP. Để tạo ra pGID1b::2xmTQ2-GID1b, một đoạn 3,9 kb ở thượng nguồn của vùng mã hóa GID1b và một đoạn 4,7 kb chứa cDNA GID1b (1,3 kb) và đoạn kết thúc (3,4 kb) đầu tiên được khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi trong Bảng bổ sung 3, sau đó được đưa vào pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) và pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), tương ứng, và cuối cùng được tái tổ hợp với pDONR221 2xmTQ268 vào vectơ mục tiêu pGreen 012567 bằng cách sử dụng nhân bản Gateway. Để tạo ra pCUC2::LSSmOrange, trình tự khởi động CUC2 (3229 bp thượng nguồn của ATG) theo sau là trình tự mã hóa của mOrange dịch chuyển Stokes lớn (LSSmOrange)69 với tín hiệu định vị nhân N7 và trình tự kết thúc phiên mã NOS được lắp ráp thành vectơ nhắm mục tiêu kanamycin pGreen bằng hệ thống tái tổ hợp Gateway 3-fragment (Invitrogen). Vectơ nhị phân thực vật được đưa vào chủng Agrobacterium tumefaciens GV3101 và được đưa vào lá Nicotiana benthamiana bằng phương pháp thâm nhiễm Agrobacterium và vào Arabidopsis thaliana Col-0 bằng phương pháp nhúng hoa. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry và pCLV3::mCherry-NLS qmRGA được phân lập từ các thế hệ F3 và F1 của các phép lai tương ứng.
Tiến hành lai RNA in situ trên các đầu chồi dài khoảng 1 cm72, thu thập và cố định ngay trong dung dịch FAA (3,7% formaldehyde, 5% axit axetic, 50% ethanol) được làm lạnh trước đến 4 °C. Sau 2 lần xử lý chân không 15 phút, chất cố định được thay đổi và các mẫu được ủ qua đêm. Các cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 và RGL3 cùng các đầu dò antisense đến 3′-UTR của chúng được tổng hợp bằng cách sử dụng các đoạn mồi được trình bày trong Bảng bổ sung 3 như mô tả của Rosier et al.73. Các đầu dò được gắn nhãn digoxigenin được phát hiện miễn dịch bằng kháng thể digoxigenin (pha loãng 3000 lần; Roche, số danh mục: 11 093 274 910) và các phần được nhuộm bằng dung dịch 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, pha loãng 250 lần)/nitroblue tetrazolium (NBT, pha loãng 200 lần).
Thời gian đăng: 10-02-2025