Sự phát triển của mô phân sinh đỉnh chồi (SAM) rất quan trọng đối với cấu trúc thân cây. Hormone thực vậtgibberellinCác GA (axit glycô) đóng vai trò quan trọng trong việc điều phối sự phát triển của cây, nhưng vai trò của chúng trong SAM (mô phân sinh đỉnh thân) vẫn chưa được hiểu rõ. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một cảm biến sinh học tỷ lệ tín hiệu GA bằng cách thiết kế protein DELLA để ức chế chức năng điều hòa thiết yếu của nó trong phản ứng phiên mã GA, đồng thời vẫn duy trì sự phân hủy của nó khi nhận diện GA. Chúng tôi chứng minh rằng cảm biến sinh học dựa trên sự phân hủy này ghi lại chính xác những thay đổi về mức độ GA và khả năng cảm nhận tế bào trong quá trình phát triển. Chúng tôi đã sử dụng cảm biến sinh học này để lập bản đồ hoạt động tín hiệu GA trong SAM. Chúng tôi cho thấy rằng tín hiệu GA cao chủ yếu xuất hiện ở các tế bào nằm giữa các mầm cơ quan, là tiền thân của các tế bào lóng thân. Sử dụng các phương pháp tăng và giảm chức năng, chúng tôi tiếp tục chứng minh rằng GA điều chỉnh hướng của mặt phẳng phân chia tế bào, thiết lập cấu trúc tế bào chuẩn của lóng thân, từ đó thúc đẩy sự hình thành lóng thân trong SAM.
Mô phân sinh đỉnh chồi (SAM), nằm ở đỉnh chồi, chứa một vùng tế bào gốc mà hoạt động của chúng tạo ra các cơ quan bên và các đốt thân theo cách thức lặp đi lặp lại trong suốt vòng đời của cây. Mỗi đơn vị lặp lại này, hay các đốt cây, bao gồm các lóng và các cơ quan bên tại các đốt, và các mô phân sinh nách lá ở nách lá1. Sự sinh trưởng và tổ chức của các đốt cây thay đổi trong quá trình phát triển. Ở Arabidopsis, sự sinh trưởng của lóng bị ức chế trong giai đoạn sinh dưỡng, và các mô phân sinh nách vẫn ở trạng thái ngủ đông ở nách lá non. Trong quá trình chuyển sang giai đoạn ra hoa, SAM trở thành mô phân sinh cụm hoa, tạo ra các lóng dài và chồi nách, cành nhỏ ở nách lá thân, và sau đó là hoa không lá2. Mặc dù chúng ta đã đạt được những tiến bộ đáng kể trong việc hiểu các cơ chế kiểm soát sự hình thành lá, hoa và cành, nhưng vẫn còn tương đối ít thông tin về cách hình thành lóng.
Việc hiểu rõ sự phân bố không gian và thời gian của GA sẽ giúp hiểu rõ hơn chức năng của các hormone này trong các mô khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Hình ảnh hóa sự phân hủy của protein lai RGA-GFP được biểu hiện dưới tác động của promoter riêng của nó cung cấp thông tin quan trọng về sự điều hòa mức GA tổng thể trong rễ15,16. Tuy nhiên, sự biểu hiện của RGA thay đổi giữa các mô17 và được điều hòa bởi GA18. Do đó, sự biểu hiện khác biệt của promoter RGA có thể dẫn đến mô hình huỳnh quang được quan sát với RGA-GFP và do đó phương pháp này không mang tính định lượng. Gần đây hơn, GA được gắn nhãn fluorescein (Fl) hoạt tính sinh học19,20 đã tiết lộ sự tích lũy GA trong nội bì rễ và sự điều hòa mức độ tế bào của nó bằng vận chuyển GA. Gần đây, cảm biến GA FRET nlsGPS1 cho thấy mức GA tương quan với sự kéo dài tế bào trong rễ, sợi và trụ mầm mọc trong bóng tối21. Tuy nhiên, như chúng ta đã thấy, nồng độ GA không phải là thông số duy nhất kiểm soát hoạt động tín hiệu GA, vì nó phụ thuộc vào các quá trình cảm nhận phức tạp. Ở đây, dựa trên sự hiểu biết của chúng ta về các con đường truyền tín hiệu DELLA và GA, chúng tôi báo cáo về sự phát triển và đặc điểm của một cảm biến sinh học tỷ lệ dựa trên sự phân hủy để đo tín hiệu GA. Để phát triển cảm biến sinh học định lượng này, chúng tôi đã sử dụng một protein RGA đột biến nhạy cảm với GA được gắn với một protein huỳnh quang và được biểu hiện rộng rãi trong các mô, cũng như một protein huỳnh quang không nhạy cảm với GA. Chúng tôi chứng minh rằng các protein RGA đột biến được gắn kết không gây nhiễu tín hiệu GA nội sinh khi được biểu hiện rộng rãi, và cảm biến sinh học này có thể định lượng hoạt động truyền tín hiệu do cả đầu vào GA và quá trình xử lý tín hiệu GA bởi bộ máy cảm biến với độ phân giải không gian và thời gian cao. Chúng tôi đã sử dụng cảm biến sinh học này để lập bản đồ phân bố không gian và thời gian của hoạt động truyền tín hiệu GA và định lượng cách GA điều chỉnh hành vi tế bào trong biểu bì SAM. Chúng tôi chứng minh rằng GA điều chỉnh hướng của mặt phẳng phân chia của các tế bào SAM nằm giữa các mầm cơ quan, do đó xác định cấu trúc tế bào chuẩn của lóng thân.
Cuối cùng, chúng tôi đặt câu hỏi liệu qmRGA có thể báo cáo những thay đổi về nồng độ GA nội sinh bằng cách sử dụng thân mầm đang phát triển hay không. Trước đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng nitrat kích thích sự tăng trưởng bằng cách tăng tổng hợp GA và từ đó, làm tăng sự phân hủy DELLA34. Theo đó, chúng tôi quan sát thấy chiều dài thân mầm ở cây con pUBQ10::qmRGA được trồng trong điều kiện cung cấp nitrat dồi dào (10 mM NO3−) dài hơn đáng kể so với cây con được trồng trong điều kiện thiếu nitrat (Hình bổ sung 6a). Phù hợp với phản ứng tăng trưởng, tín hiệu GA cao hơn ở thân mầm của cây con được trồng trong điều kiện 10 mM NO3− so với cây con được trồng trong điều kiện không có nitrat (Hình bổ sung 6b, c). Do đó, qmRGA cũng cho phép theo dõi những thay đổi trong tín hiệu GA do những thay đổi nội sinh về nồng độ GA gây ra.
Để hiểu liệu hoạt động truyền tín hiệu GA được phát hiện bởi qmRGA có phụ thuộc vào nồng độ GA và khả năng cảm nhận GA hay không, như dự kiến dựa trên thiết kế cảm biến, chúng tôi đã phân tích sự biểu hiện của ba thụ thể GID1 trong mô sinh dưỡng và sinh sản. Ở cây con, dòng báo cáo GID1-GUS cho thấy GID1a và c được biểu hiện mạnh ở lá mầm (Hình 3a–c). Ngoài ra, cả ba thụ thể đều được biểu hiện ở lá, mầm rễ bên, đầu rễ (ngoại trừ chóp rễ của GID1b) và hệ mạch (Hình 3a–c). Trong mô đỉnh sinh trưởng (SAM) của cụm hoa, chúng tôi chỉ phát hiện tín hiệu GUS đối với GID1b và 1c (Hình bổ sung 7a–c). Lai tạo tại chỗ đã xác nhận các mô hình biểu hiện này và chứng minh thêm rằng GID1c được biểu hiện đồng đều ở mức thấp trong SAM, trong khi GID1b cho thấy sự biểu hiện cao hơn ở vùng ngoại vi của SAM (Hình bổ sung 7d–l). Sự kết hợp dịch mã pGID1b::2xmTQ2-GID1b cũng cho thấy phạm vi biểu hiện GID1b theo cấp độ, từ biểu hiện thấp hoặc không có ở trung tâm của SAM đến biểu hiện cao ở ranh giới cơ quan (Hình bổ sung 7m). Do đó, các thụ thể GID1 không được phân bố đồng đều trên khắp và trong các mô. Trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi cũng quan sát thấy rằng sự biểu hiện quá mức của GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) làm tăng độ nhạy của qmRGA trong trụ mầm đối với việc ứng dụng GA bên ngoài (Hình 3d, e). Ngược lại, huỳnh quang được đo bằng qd17mRGA trong trụ mầm không nhạy cảm với việc xử lý GA3 (Hình 3f, g). Đối với cả hai thí nghiệm, cây con được xử lý bằng nồng độ GA cao (100 μM GA3) để đánh giá hành vi nhanh chóng của cảm biến, trong đó khả năng liên kết với thụ thể GID1 được tăng cường hoặc mất đi. Tóm lại, những kết quả này khẳng định rằng cảm biến sinh học qmRGA đóng vai trò kết hợp như một cảm biến GA và GA, đồng thời cho thấy sự biểu hiện khác biệt của thụ thể GID1 có thể điều chỉnh đáng kể khả năng phát xạ của cảm biến.
Cho đến nay, sự phân bố tín hiệu GA trong SAM vẫn chưa rõ ràng. Do đó, chúng tôi đã sử dụng cây biểu hiện qmRGA và chất chỉ thị tế bào gốc pCLV3::mCherry-NLS35 để tính toán bản đồ định lượng độ phân giải cao về hoạt động tín hiệu GA, tập trung vào lớp L1 (biểu bì; Hình 4a, b, xem Phương pháp và Phương pháp bổ sung), vì L1 đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của SAM36. Ở đây, sự biểu hiện pCLV3::mCherry-NLS cung cấp một điểm tham chiếu hình học cố định để phân tích sự phân bố không gian-thời gian của hoạt động tín hiệu GA37. Mặc dù GA được coi là cần thiết cho sự phát triển của các cơ quan bên4, chúng tôi nhận thấy rằng tín hiệu GA thấp trong mầm hoa (P) bắt đầu từ giai đoạn P3 (Hình 4a, b), trong khi mầm P1 và P2 non có hoạt động vừa phải tương tự như ở vùng trung tâm (Hình 4a, b). Hoạt động tín hiệu GA cao hơn được phát hiện tại ranh giới mầm cơ quan, bắt đầu từ P1/P2 (ở hai bên ranh giới) và đạt đỉnh điểm ở P4, cũng như trong tất cả các tế bào của vùng ngoại vi nằm giữa các mầm (Hình 4a, b và Hình bổ sung 8a, b). Hoạt động tín hiệu GA cao hơn này được quan sát thấy không chỉ ở lớp biểu bì mà còn ở lớp L2 và lớp L3 phía trên (Hình bổ sung 8b). Mô hình tín hiệu GA được phát hiện trong SAM bằng qmRGA cũng không thay đổi theo thời gian (Hình bổ sung 8c–f, k). Mặc dù cấu trúc qd17mRGA bị giảm biểu hiện một cách có hệ thống trong SAM của cây T3 từ năm dòng độc lập mà chúng tôi đã mô tả chi tiết, chúng tôi vẫn có thể phân tích các mô hình huỳnh quang thu được với cấu trúc pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Hình bổ sung 8g–j, l). Trong dòng đối chứng này, chỉ phát hiện thấy những thay đổi nhỏ về tỷ lệ huỳnh quang trong SAM, nhưng ở trung tâm SAM, chúng tôi quan sát thấy sự giảm rõ rệt và bất ngờ của VENUS liên quan đến TagBFP. Điều này xác nhận rằng mô hình tín hiệu quan sát được bằng qmRGA phản ánh sự phân hủy phụ thuộc GA của mRGA-VENUS, nhưng cũng chứng minh rằng qmRGA có thể đánh giá quá cao hoạt động tín hiệu GA ở trung tâm mô phân sinh. Tóm lại, kết quả của chúng tôi cho thấy một mô hình tín hiệu GA chủ yếu phản ánh sự phân bố của các mầm. Sự phân bố của vùng giữa các mầm (IPR) này là do sự thiết lập dần dần hoạt động tín hiệu GA cao giữa mầm đang phát triển và vùng trung tâm, đồng thời hoạt động tín hiệu GA trong mầm giảm đi (Hình 4c, d).
Sự phân bố của các thụ thể GID1b và GID1c (xem ở trên) cho thấy rằng sự biểu hiện khác biệt của các thụ thể GA giúp định hình mô hình hoạt động tín hiệu GA trong SAM. Chúng tôi tự hỏi liệu sự tích lũy GA khác biệt có thể liên quan hay không. Để điều tra khả năng này, chúng tôi đã sử dụng cảm biến FRET GA nlsGPS121. Tần suất kích hoạt tăng lên được phát hiện trong SAM của nlsGPS1 được xử lý với 10 μM GA4+7 trong 100 phút (Hình bổ sung 9a–e), cho thấy nlsGPS1 phản ứng với những thay đổi về nồng độ GA trong SAM, giống như trong rễ21. Phân bố không gian của tần suất kích hoạt nlsGPS1 cho thấy mức GA tương đối thấp ở các lớp ngoài của SAM, nhưng cho thấy chúng tăng cao ở trung tâm và ở các vùng biên của SAM (Hình 4e và Hình bổ sung 9a,c). Điều này cho thấy GA cũng được phân bố trong SAM với một mô hình không gian tương tự như mô hình được tiết lộ bởi qmRGA. Như một phương pháp bổ sung, chúng tôi cũng xử lý SAM bằng GA huỳnh quang (GA3-, GA4-, GA7-Fl) hoặc chỉ Fl làm đối chứng âm. Tín hiệu Fl được phân bố khắp SAM, bao gồm cả vùng trung tâm và mầm, mặc dù với cường độ thấp hơn (Hình 4j và Hình bổ sung 10d). Ngược lại, cả ba GA-Fl đều tích tụ đặc biệt trong ranh giới của mầm và ở các mức độ khác nhau trong phần còn lại của IPR, với GA7-Fl tích tụ trong vùng lớn nhất của IPR (Hình 4k và Hình bổ sung 10a,b). Định lượng cường độ huỳnh quang cho thấy tỷ lệ cường độ IPR so với không phải IPR cao hơn ở SAM được xử lý bằng GA-Fl so với SAM được xử lý bằng Fl (Hình 4l và Hình bổ sung 10c). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy GA có mặt ở nồng độ cao hơn trong các tế bào IPR nằm gần ranh giới cơ quan nhất. Điều này cho thấy mô hình hoạt động tín hiệu GA của SAM là kết quả của cả sự biểu hiện khác biệt của thụ thể GA và sự tích lũy khác biệt của GA trong các tế bào IPR gần ranh giới cơ quan. Do đó, phân tích của chúng tôi đã tiết lộ một mô hình không gian-thời gian bất ngờ của tín hiệu GA, với hoạt động thấp hơn ở trung tâm và mầm của SAM và hoạt động cao hơn ở IPR trong vùng ngoại vi.
Để hiểu rõ vai trò của hoạt động tín hiệu GA khác biệt trong SAM, chúng tôi đã phân tích mối tương quan giữa hoạt động tín hiệu GA, sự giãn nở tế bào và sự phân chia tế bào bằng cách sử dụng hình ảnh thời gian thực của SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Do vai trò của GA trong điều hòa tăng trưởng, mối tương quan tích cực với các thông số giãn nở tế bào là điều được dự đoán. Vì vậy, trước tiên chúng tôi đã so sánh bản đồ hoạt động tín hiệu GA với bản đồ tốc độ tăng trưởng bề mặt tế bào (như một chỉ số đại diện cho cường độ giãn nở tế bào đối với một tế bào nhất định và đối với các tế bào con khi phân chia) và với bản đồ độ bất đẳng hướng tăng trưởng, đo lường hướng giãn nở tế bào (cũng được sử dụng ở đây cho một tế bào nhất định và đối với các tế bào con khi phân chia; Hình 5a,b, xem Phương pháp và Phương pháp bổ sung). Bản đồ tốc độ tăng trưởng bề mặt tế bào SAM của chúng tôi phù hợp với các quan sát trước đây38,39, với tốc độ tăng trưởng tối thiểu ở vùng biên và tốc độ tăng trưởng tối đa ở các bông hoa đang phát triển (Hình 5a). Phân tích thành phần chính (PCA) cho thấy hoạt động tín hiệu GA có tương quan nghịch với cường độ tăng trưởng bề mặt tế bào (Hình 5c). Chúng tôi cũng chỉ ra rằng các trục biến thiên chính, bao gồm tín hiệu GA đầu vào và cường độ tăng trưởng, vuông góc với hướng được xác định bởi biểu hiện CLV3 cao, xác nhận việc loại trừ các tế bào từ trung tâm SAM trong các phân tích còn lại. Phân tích tương quan Spearman đã xác nhận kết quả PCA (Hình 5d), cho thấy tín hiệu GA cao hơn trong IPR không dẫn đến sự giãn nở tế bào cao hơn. Tuy nhiên, phân tích tương quan cho thấy mối tương quan dương nhẹ giữa hoạt động tín hiệu GA và tính dị hướng tăng trưởng (Hình 5c, d), cho thấy tín hiệu GA cao hơn trong IPR ảnh hưởng đến hướng tăng trưởng của tế bào và có thể cả vị trí của mặt phẳng phân chia tế bào.
a, b Bản đồ nhiệt về mức tăng trưởng bề mặt trung bình (a) và độ bất đẳng hướng tăng trưởng (b) trong SAM được tính trung bình trên bảy cây độc lập (được sử dụng làm đại diện cho cường độ và hướng giãn nở của tế bào, tương ứng). c Phân tích PCA bao gồm các biến sau: tín hiệu GA, cường độ tăng trưởng bề mặt, độ bất đẳng hướng tăng trưởng bề mặt và biểu hiện CLV3. Thành phần PCA 1 chủ yếu tương quan nghịch với cường độ tăng trưởng bề mặt và tương quan thuận với tín hiệu GA. Thành phần PCA 2 chủ yếu tương quan thuận với độ bất đẳng hướng tăng trưởng bề mặt và tương quan nghịch với biểu hiện CLV3. Phần trăm thể hiện sự biến thiên được giải thích bởi mỗi thành phần. d Phân tích tương quan Spearman giữa tín hiệu GA, cường độ tăng trưởng bề mặt và độ bất đẳng hướng tăng trưởng bề mặt ở quy mô mô, không bao gồm CZ. Con số bên phải là giá trị hệ số tương quan Spearman rho giữa hai biến. Dấu hoa thị chỉ ra các trường hợp tương quan/tương quan nghịch có ý nghĩa thống kê cao. e Hình ảnh 3D của tế bào Col-0 SAM L1 bằng kính hiển vi confocal. Các vách tế bào mới hình thành trong SAM (nhưng không phải ở mầm) sau 10 giờ được tô màu theo giá trị góc của chúng. Thanh màu được hiển thị ở góc dưới bên phải. Hình chèn cho thấy hình ảnh 3D tương ứng ở thời điểm 0 giờ. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. f Biểu đồ hộp hiển thị tốc độ phân chia tế bào trong SAM Col-0 IPR và không IPR (n = 10 cây độc lập). Đường trung tâm hiển thị giá trị trung vị, và các đường viền hộp biểu thị phân vị thứ 25 và thứ 75. Các đường râu biểu thị giá trị tối thiểu và tối đa được xác định bằng phần mềm R. Giá trị P được thu được bằng phép thử t hai phía của Welch. g, h Sơ đồ minh họa (g) cách đo góc của vách tế bào mới (màu đỏ tươi) so với hướng xuyên tâm từ tâm của SAM (đường chấm trắng) (chỉ xem xét các giá trị góc nhọn, tức là 0–90°), và (h) các hướng chu vi/bên và xuyên tâm bên trong mô phân sinh. i. Biểu đồ tần suất định hướng mặt phẳng phân chia tế bào trên vùng SAM (xanh đậm), IPR (xanh trung bình) và vùng không phải IPR (xanh nhạt). Giá trị P được thu được bằng phép thử Kolmogorov-Smirnov hai phía. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. j. Biểu đồ tần suất định hướng mặt phẳng phân chia tế bào của vùng IPR xung quanh P3 (xanh lá nhạt), P4 (xanh lá trung bình) và P5 (xanh đậm). Giá trị P được thu được bằng phép thử Kolmogorov-Smirnov hai phía. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự.
Do đó, tiếp theo chúng tôi đã điều tra mối tương quan giữa tín hiệu GA và hoạt động phân chia tế bào bằng cách xác định các vách tế bào mới hình thành trong quá trình thí nghiệm (Hình 5e). Phương pháp này cho phép chúng tôi đo tần suất và hướng phân chia tế bào. Thật ngạc nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng tần suất phân chia tế bào ở vùng IPR và phần còn lại của SAM (không phải IPR, Hình 5f) là tương tự nhau, cho thấy sự khác biệt về tín hiệu GA giữa các tế bào IPR và không phải IPR không ảnh hưởng đáng kể đến sự phân chia tế bào. Điều này, cùng với mối tương quan tích cực giữa tín hiệu GA và tính dị hướng tăng trưởng, đã thúc đẩy chúng tôi xem xét liệu hoạt động tín hiệu GA có thể ảnh hưởng đến hướng của mặt phẳng phân chia tế bào hay không. Chúng tôi đo hướng của vách tế bào mới dưới dạng một góc nhọn so với trục xuyên tâm nối tâm mô phân sinh và tâm của vách tế bào mới (Hình 5e-i) và quan sát thấy xu hướng rõ ràng là các tế bào phân chia ở các góc gần 90° so với trục xuyên tâm, với tần suất cao nhất được quan sát thấy ở 70–80° (23,28%) và 80–90° (22,62%) (Hình 5e,i), tương ứng với sự phân chia tế bào theo hướng chu vi/ngang (Hình 5h). Để kiểm tra sự đóng góp của tín hiệu GA vào hành vi phân chia tế bào này, chúng tôi đã phân tích các thông số phân chia tế bào trong vùng IPR và vùng không phải IPR một cách riêng biệt (Hình 5i). Chúng tôi quan sát thấy rằng sự phân bố góc phân chia trong các tế bào IPR khác với sự phân bố trong các tế bào không phải IPR hoặc trong các tế bào trong toàn bộ SAM, với các tế bào IPR thể hiện tỷ lệ phân chia tế bào theo chiều ngang/hình tròn cao hơn, tức là 70–80° và 80–90° (tương ứng là 33,86% và 30,71%) (Hình 5i). Do đó, quan sát của chúng tôi cho thấy mối liên hệ giữa tín hiệu GA cao và hướng mặt phẳng phân chia tế bào gần với hướng chu vi, tương tự như mối tương quan giữa hoạt động tín hiệu GA và tính dị hướng tăng trưởng (Hình 5c, d). Để thiết lập thêm sự bảo tồn không gian của mối liên hệ này, chúng tôi đã đo hướng mặt phẳng phân chia trong các tế bào IPR xung quanh mầm bắt đầu từ P3, vì hoạt động tín hiệu GA cao nhất được phát hiện trong vùng này bắt đầu từ P4 (Hình 4). Góc phân chia của IPR xung quanh P3 và P4 không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, mặc dù tần suất phân chia tế bào theo chiều ngang tăng lên được quan sát thấy ở IPR xung quanh P4 (Hình 5j). Tuy nhiên, ở các tế bào IPR xung quanh P5, sự khác biệt về hướng của mặt phẳng phân chia tế bào trở nên có ý nghĩa thống kê, với sự gia tăng mạnh về tần suất phân chia tế bào theo chiều ngang (Hình 5j). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy tín hiệu GA có thể kiểm soát hướng phân chia tế bào trong SAM, phù hợp với các báo cáo trước đây40,41 cho thấy tín hiệu GA cao có thể gây ra sự định hướng theo chiều ngang của các phân chia tế bào trong IPR.
Người ta dự đoán rằng các tế bào trong IPR sẽ không được kết hợp vào mầm mà là vào các lóng2,42,43. Hướng phân chia tế bào theo chiều ngang trong IPR có thể dẫn đến sự sắp xếp điển hình của các hàng tế bào biểu bì song song theo chiều dọc trong các lóng. Những quan sát của chúng tôi được mô tả ở trên cho thấy tín hiệu GA có thể đóng vai trò trong quá trình này bằng cách điều chỉnh hướng phân chia tế bào.
Mất chức năng của một số gen DELLA dẫn đến phản ứng GA liên tục, và các đột biến della có thể được sử dụng để kiểm tra giả thuyết này44. Đầu tiên, chúng tôi đã phân tích mô hình biểu hiện của năm gen DELLA trong SAM. Sự kết hợp phiên mã của dòng GUS45 cho thấy GAI, RGA, RGL1 và RGL2 (ở mức độ thấp hơn nhiều) được biểu hiện trong SAM (Hình bổ sung 11a–d). Lai tại chỗ tiếp tục chứng minh rằng mRNA GAI tích lũy đặc biệt trong các mầm và hoa đang phát triển (Hình bổ sung 11e). mRNA RGL1 và RGL3 được phát hiện khắp tán SAM và trong các hoa già hơn, trong khi mRNA RGL2 dồi dào hơn ở vùng biên (Hình bổ sung 11f–h). Hình ảnh hiển vi confocal của SAM pRGL3::RGL3-GFP đã xác nhận sự biểu hiện được quan sát bằng lai tại chỗ và cho thấy protein RGL3 tích lũy ở phần trung tâm của SAM (Hình bổ sung 11i). Sử dụng dòng pRGA::GFP-RGA, chúng tôi cũng nhận thấy protein RGA tích lũy trong SAM, nhưng lượng của nó giảm dần ở vùng biên bắt đầu từ P4 (Hình bổ sung 11j). Đáng chú ý, mô hình biểu hiện của RGL3 và RGA phù hợp với hoạt động tín hiệu GA cao hơn trong IPR, như được phát hiện bởi qmRGA (Hình 4). Hơn nữa, những dữ liệu này cho thấy tất cả các DELLA đều được biểu hiện trong SAM và sự biểu hiện của chúng trải rộng khắp toàn bộ SAM.
Tiếp theo, chúng tôi đã phân tích các thông số phân chia tế bào trong SAM kiểu hoang dã (Ler, đối chứng) và các đột biến gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della ngũ bội (toàn cục) (Hình 6a, b). Điều thú vị là, chúng tôi quan sát thấy sự thay đổi có ý nghĩa thống kê trong phân bố tần suất góc phân chia tế bào ở SAM đột biến toàn cục della so với kiểu hoang dã (Hình 6c). Sự thay đổi này ở đột biến toàn cục della là do sự gia tăng tần suất các góc 80–90° (34,71% so với 24,55%) và, ở mức độ thấp hơn, các góc 70–80° (23,78% so với 20,18%), tức là tương ứng với các phân chia tế bào ngang (Hình 6c). Tần suất các phân chia không ngang (0–60°) cũng thấp hơn ở đột biến toàn cục della (Hình 6c). Tần suất phân chia tế bào theo chiều ngang tăng lên đáng kể ở vùng SAM của đột biến toàn cầu della (Hình 6b). Tần suất phân chia tế bào theo chiều ngang ở vùng IPR cũng cao hơn ở đột biến toàn cầu della so với kiểu hoang dã (Hình 6d). Bên ngoài vùng IPR, kiểu hoang dã có sự phân bố góc phân chia tế bào đồng đều hơn, trong khi đột biến toàn cầu della lại ưu tiên phân chia theo chiều tiếp tuyến giống như vùng IPR (Hình 6e). Chúng tôi cũng định lượng hướng phân chia tế bào ở vùng SAM của đột biến kép ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 và ga2ox6-2), một nền đột biến không hoạt động GA trong đó GA tích lũy. Phù hợp với sự gia tăng nồng độ GA, SAM của cụm hoa đột biến ga2ox năm lần lớn hơn so với Col-0 (Hình bổ sung 12a, b), và so với Col-0, SAM của ga2ox năm lần cho thấy sự phân bố góc phân chia tế bào khác biệt rõ rệt, với tần suất góc tăng từ 50° lên 90°, tức là lại ưu tiên các phân chia tiếp tuyến (Hình bổ sung 12a–c). Như vậy, chúng tôi chứng minh rằng sự hoạt hóa liên tục của tín hiệu GA và sự tích lũy GA gây ra sự phân chia tế bào theo chiều ngang trong IPR và phần còn lại của SAM.
a, b Hình ảnh 3D trực quan hóa lớp L1 của SAM nhuộm PI của Ler (a) và đột biến della toàn cục (b) bằng kính hiển vi confocal. Các vách tế bào mới hình thành trong SAM (nhưng không phải ở mầm) trong khoảng thời gian 10 giờ được hiển thị và tô màu theo giá trị góc của chúng. Hình nhỏ hiển thị SAM ở thời điểm 0 giờ. Thanh màu được hiển thị ở góc dưới bên phải. Mũi tên trong (b) chỉ vào một ví dụ về các hàng tế bào được sắp xếp thẳng hàng trong đột biến della toàn cục. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. c So sánh phân bố tần suất định hướng mặt phẳng phân chia tế bào trong toàn bộ SAM (d), IPR (e) và không IPR (f) giữa Ler và della toàn cục. Giá trị P được thu được bằng cách sử dụng phép thử Kolmogorov-Smirnov hai phía. f, g Hình ảnh 3D trực quan hóa hình ảnh confocal của SAM nhuộm PI của cây chuyển gen Col-0 (i) và pCUC2::gai-1-VENUS (j). Hình (a, b) cho thấy các vách tế bào mới (nhưng không phải mầm) được hình thành trong SAM trong vòng 10 giờ. Thí nghiệm được lặp lại hai lần với kết quả tương tự. h–j So sánh phân bố tần suất định hướng mặt phẳng phân chia tế bào nằm trong toàn bộ SAM (h), IPR (i) và không phải IPR (j) giữa cây Col-0 và cây pCUC2::gai-1-VENUS. Giá trị P được thu được bằng cách sử dụng phép thử Kolmogorov–Smirnov hai phía.
Tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm tác động của việc ức chế tín hiệu GA đặc hiệu trong IPR. Để làm được điều này, chúng tôi đã sử dụng promoter cotyledon cup 2 (CUC2) để điều khiển biểu hiện của protein gai-1 trội âm tính được gắn với VENUS (trong dòng pCUC2::gai-1-VENUS). Trong SAM kiểu hoang dã, promoter CUC2 điều khiển biểu hiện của hầu hết các IPR trong SAM, bao gồm cả các tế bào biên, từ P4 trở đi, và biểu hiện đặc hiệu tương tự đã được quan sát thấy ở cây pCUC2::gai-1-VENUS (xem bên dưới). Sự phân bố góc phân chia tế bào trên SAM hoặc IPR của cây pCUC2::gai-1-VENUS không khác biệt đáng kể so với kiểu hoang dã, mặc dù bất ngờ là chúng tôi phát hiện ra rằng các tế bào không có IPR trong những cây này phân chia với tần suất cao hơn, từ 80–90° (Hình 6f–j).
Người ta cho rằng hướng phân chia tế bào phụ thuộc vào hình dạng của SAM, đặc biệt là ứng suất kéo tạo ra bởi độ cong của mô46. Do đó, chúng tôi đã đặt câu hỏi liệu hình dạng của SAM có bị thay đổi ở cây đột biến toàn cầu della và cây pCUC2::gai-1-VENUS hay không. Như đã báo cáo trước đây12, kích thước của SAM ở cây đột biến toàn cầu della lớn hơn so với cây kiểu hoang dã (Hình bổ sung 13a, b, d). Lai ghép tại chỗ RNA CLV3 và STM đã xác nhận sự mở rộng mô phân sinh ở cây đột biến della và cho thấy thêm sự mở rộng theo chiều ngang của hốc tế bào gốc (Hình bổ sung 13e, f, h, i). Tuy nhiên, độ cong của SAM tương tự nhau ở cả hai kiểu gen (Hình bổ sung 13k, m, n, p). Chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng kích thước tương tự ở thể đột biến tứ bội gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della mà không có sự thay đổi về độ cong so với kiểu hoang dã (Hình bổ sung 13c, d, g, j, l, o, p). Tần suất định hướng phân chia tế bào cũng bị ảnh hưởng ở thể đột biến tứ bội della, nhưng ở mức độ ít hơn so với thể đột biến đơn khối della (Hình bổ sung 12d–f). Hiệu ứng liều lượng này, cùng với việc không ảnh hưởng đến độ cong, cho thấy hoạt động RGL3 còn lại trong thể đột biến tứ bội Della hạn chế sự thay đổi hướng phân chia tế bào do mất hoạt động DELLA và sự thay đổi trong phân chia tế bào theo chiều ngang xảy ra do phản ứng với sự thay đổi hoạt động tín hiệu GA chứ không phải sự thay đổi hình học SAM. Như đã mô tả ở trên, chất xúc tiến CUC2 điều khiển biểu hiện IPR trong SAM bắt đầu từ P4 (Hình bổ sung 14a, b), và ngược lại, SAM của pCUC2::gai-1-VENUS có kích thước nhỏ hơn nhưng độ cong cao hơn (Hình bổ sung 14c–h). Sự thay đổi về hình thái SAM của pCUC2::gai-1-VENUS này có thể dẫn đến sự phân bố ứng suất cơ học khác nhau so với kiểu hoang dã, trong đó ứng suất chu vi cao bắt đầu ở khoảng cách ngắn hơn từ tâm SAM47. Ngoài ra, những thay đổi về hình thái SAM của pCUC2::gai-1-VENUS có thể là kết quả của những thay đổi về tính chất cơ học khu vực do biểu hiện gen chuyển48 gây ra. Trong cả hai trường hợp, điều này có thể bù đắp một phần tác động của những thay đổi trong tín hiệu GA bằng cách tăng khả năng tế bào phân chia theo hướng chu vi/ngang, giải thích những quan sát của chúng tôi.
Tóm lại, dữ liệu của chúng tôi xác nhận rằng tín hiệu GA cao hơn đóng vai trò tích cực trong định hướng ngang của mặt phẳng phân chia tế bào trong IPR. Chúng cũng cho thấy độ cong của mô phân sinh cũng ảnh hưởng đến định hướng của mặt phẳng phân chia tế bào trong IPR.
Hướng ngang của mặt phẳng phân chia trong IPR, do hoạt động tín hiệu GA cao, cho thấy GA sắp xếp trước một hàng tế bào xuyên tâm trong biểu bì bên trong SAM để xác định cấu trúc tế bào sẽ được tìm thấy sau này trong lóng biểu bì. Thật vậy, các hàng tế bào như vậy thường xuyên được nhìn thấy trong hình ảnh SAM của các đột biến toàn cầu della (Hình 6b). Do đó, để khám phá thêm chức năng phát triển của mô hình không gian của tín hiệu GA trong SAM, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chụp ảnh tua nhanh thời gian để phân tích cấu trúc không gian của các tế bào trong IPR ở cây kiểu hoang dã (Ler và Col-0), các đột biến toàn cầu della và cây chuyển gen pCUC2::gai-1-VENUS.
Chúng tôi nhận thấy rằng qmRGA cho thấy hoạt động tín hiệu GA trong IPR tăng từ P1/P2 và đạt đỉnh điểm ở P4, và mô hình này duy trì ổn định theo thời gian (Hình 4a–f và Hình bổ sung 8c–f, k). Để phân tích sự sắp xếp không gian của các tế bào trong IPR với tín hiệu GA tăng dần, chúng tôi đã đánh dấu các tế bào Ler IPR phía trên và hai bên của P4 theo số phận phát triển của chúng được phân tích 34 giờ sau lần quan sát đầu tiên, tức là hơn hai chu kỳ lục lạp, cho phép chúng tôi theo dõi các tế bào IPR trong quá trình phát triển mầm từ P1/P2 đến P4. Chúng tôi đã sử dụng ba màu khác nhau: màu vàng cho những tế bào được tích hợp vào mầm gần P4, màu xanh lá cây cho những tế bào nằm trong IPR, và màu tím cho những tế bào tham gia vào cả hai quá trình (Hình 7a–c). Tại t0 (0 giờ), có thể nhìn thấy 1–2 lớp tế bào IPR phía trước P4 (Hình 7a). Đúng như dự đoán, khi các tế bào này phân chia, chúng chủ yếu phân chia theo mặt phẳng ngang (Hình 7a–c). Kết quả tương tự cũng thu được khi sử dụng Col-0 SAM (tập trung vào P3, có nếp gấp ở rìa tương tự như P4 ở Ler), mặc dù ở kiểu gen này, nếp gấp hình thành ở rìa hoa che khuất các tế bào IPR nhanh hơn (Hình 7g–i). Như vậy, kiểu phân chia của các tế bào IPR sắp xếp trước các tế bào thành các hàng xuyên tâm, giống như ở các lóng thân. Sự sắp xếp của các hàng xuyên tâm và vị trí của các tế bào IPR giữa các cơ quan kế tiếp cho thấy rằng các tế bào này là tiền thân của lóng thân.
Tại đây, chúng tôi đã phát triển một cảm biến sinh học tín hiệu GA tỷ lệ, qmRGA, cho phép lập bản đồ định lượng hoạt động tín hiệu GA do sự kết hợp nồng độ GA và thụ thể GA tạo ra, đồng thời giảm thiểu sự can thiệp vào các con đường tín hiệu nội sinh, từ đó cung cấp thông tin về chức năng GA ở cấp độ tế bào. Để đạt được điều này, chúng tôi đã tạo ra một protein DELLA được sửa đổi, mRGA, đã mất khả năng liên kết với các đối tác tương tác của DELLA nhưng vẫn nhạy cảm với quá trình phân giải protein do GA gây ra. qmRGA phản ứng với cả những thay đổi ngoại sinh và nội sinh về nồng độ GA, và các đặc tính cảm biến động của nó cho phép đánh giá những thay đổi không gian-thời gian trong hoạt động tín hiệu GA trong quá trình phát triển. qmRGA cũng là một công cụ rất linh hoạt vì nó có thể được điều chỉnh cho các mô khác nhau bằng cách thay đổi chất xúc tiến được sử dụng cho biểu hiện của nó (nếu cần), và do tính chất được bảo tồn của con đường tín hiệu GA và mô típ PFYRE trên khắp các loài thực vật hạt kín, nên nó có khả năng được chuyển giao cho các loài khác22. Phù hợp với điều này, một đột biến tương đương trong protein SLR1 DELLA của lúa (HYY497AAA) cũng được chứng minh là có khả năng ức chế hoạt động ức chế tăng trưởng của SLR1 trong khi chỉ làm giảm nhẹ sự phân hủy do GA trung gian, tương tự như mRGA23. Đáng chú ý, các nghiên cứu gần đây trên Arabidopsis cho thấy rằng một đột biến axit amin duy nhất trong miền PFYRE (S474L) đã làm thay đổi hoạt động phiên mã của RGA mà không ảnh hưởng đến khả năng tương tác với các đối tác yếu tố phiên mã50. Mặc dù đột biến này rất gần với 3 sự thay thế axit amin có trong mRGA, các nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng hai đột biến này làm thay đổi các đặc điểm khác nhau của DELLA. Mặc dù hầu hết các đối tác yếu tố phiên mã liên kết với các miền LHR1 và SAW của DELLA26,51, một số axit amin được bảo tồn trong miền PFYRE có thể giúp ổn định các tương tác này.
Sự phát triển lóng thân là một đặc điểm quan trọng trong cấu trúc thực vật và cải thiện năng suất. qmRGA đã tiết lộ hoạt động tín hiệu GA cao hơn trong các tế bào tiền thân lóng thân IPR. Bằng cách kết hợp hình ảnh định lượng và di truyền học, chúng tôi đã chỉ ra rằng các mô hình tín hiệu GA chồng lên các mặt phẳng phân chia tế bào tròn/ngang trong biểu bì SAM, định hình tổ chức phân chia tế bào cần thiết cho sự phát triển lóng thân. Một số chất điều hòa hướng mặt phẳng phân chia tế bào đã được xác định trong quá trình phát triển52,53. Công trình của chúng tôi cung cấp một ví dụ rõ ràng về cách hoạt động tín hiệu GA điều chỉnh thông số tế bào này. DELLA có thể tương tác với các phức hợp protein gấp nếp trước41, vì vậy tín hiệu GA có thể điều chỉnh hướng mặt phẳng phân chia tế bào bằng cách ảnh hưởng trực tiếp đến hướng vi ống vỏ40,41,54,55. Chúng tôi đã bất ngờ chỉ ra rằng trong SAM, mối tương quan của hoạt động tín hiệu GA cao hơn không phải là sự kéo dài hoặc phân chia tế bào, mà chỉ là tính dị hướng tăng trưởng, điều này phù hợp với tác động trực tiếp của GA lên hướng phân chia tế bào trong IPR. Tuy nhiên, chúng ta không thể loại trừ khả năng tác động này cũng có thể là gián tiếp, ví dụ như thông qua sự làm mềm thành tế bào do GA gây ra56. Những thay đổi trong đặc tính thành tế bào gây ra ứng suất cơ học57,58, điều này cũng có thể ảnh hưởng đến hướng của mặt phẳng phân chia tế bào bằng cách ảnh hưởng đến hướng của các vi ống vỏ39,46,59. Tác động kết hợp của ứng suất cơ học do GA gây ra và sự điều hòa trực tiếp hướng của vi ống bởi GA có thể liên quan đến việc tạo ra một mô hình cụ thể về hướng phân chia tế bào trong IPR để xác định các lóng thân, và cần có thêm các nghiên cứu để kiểm chứng ý tưởng này. Tương tự, các nghiên cứu trước đây đã nhấn mạnh tầm quan trọng của các protein tương tác DELLA TCP14 và 15 trong việc kiểm soát sự hình thành lóng thân60,61 và các yếu tố này có thể làm trung gian cho hoạt động của GA cùng với BREVIPEDICELLUS (BP) và PENNYWISE (PNY), điều chỉnh sự phát triển của lóng thân và đã được chứng minh là ảnh hưởng đến tín hiệu GA2,62. Do DELLA tương tác với các con đường truyền tín hiệu brassinosteroid, ethylene, axit jasmonic và axit abscisic (ABA)63,64 và các hormone này có thể ảnh hưởng đến hướng của vi ống65, nên tác động của GA lên hướng phân chia tế bào cũng có thể được trung gian bởi các hormone khác.
Các nghiên cứu tế bào học ban đầu cho thấy cả vùng bên trong và bên ngoài của SAM ở Arabidopsis đều cần thiết cho sự phát triển lóng thân2,42. Việc GA chủ động điều chỉnh sự phân chia tế bào trong các mô bên trong12 hỗ trợ chức năng kép của GA trong việc điều chỉnh kích thước mô phân sinh và lóng thân trong SAM. Mô hình phân chia tế bào theo hướng nhất định cũng được điều chỉnh chặt chẽ trong mô SAM bên trong, và sự điều chỉnh này rất cần thiết cho sự phát triển của thân cây52. Sẽ rất thú vị khi xem xét liệu GA có đóng vai trò trong việc định hướng mặt phẳng phân chia tế bào trong cấu trúc SAM bên trong, từ đó đồng bộ hóa sự xác định và phát triển của lóng thân trong SAM hay không.
Cây được trồng trong ống nghiệm trên đất hoặc môi trường Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) bổ sung 1% sucrose và 1% agar (Sigma) trong điều kiện tiêu chuẩn (16 giờ chiếu sáng, 22 °C), ngoại trừ các thí nghiệm về sự phát triển của trụ mầm và rễ, trong đó cây con được trồng trên đĩa thẳng đứng dưới ánh sáng liên tục và nhiệt độ 22 °C. Đối với các thí nghiệm về nitrat, cây được trồng trên môi trường MS đã được điều chỉnh (môi trường trồng cây bioWORLD) bổ sung lượng nitrat thích hợp (0 hoặc 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, 1% sucrose và 1% A-agar (Sigma) trong điều kiện ngày dài.
Đoạn cDNA GID1a được chèn vào pDONR221 được tái tổ hợp với pDONR P4-P1R-pUBQ10 và pDONR P2R-P3-mCherry vào pB7m34GW để tạo ra pUBQ10::GID1a-mCherry. Đoạn DNA IDD2 được chèn vào pDONR221 được tái tổ hợp vào pB7RWG266 để tạo ra p35S:IDD2-RFP. Để tạo ra pGID1b::2xmTQ2-GID1b, trước tiên, một đoạn 3,9 kb nằm phía thượng nguồn vùng mã hóa GID1b và một đoạn 4,7 kb chứa cDNA GID1b (1,3 kb) và trình tự kết thúc (3,4 kb) được khuếch đại bằng cách sử dụng các mồi trong Bảng bổ sung 3, sau đó được chèn vào pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) và pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) tương ứng, và cuối cùng được tái tổ hợp với pDONR221 2xmTQ268 vào vector đích pGreen 012567 bằng phương pháp nhân bản Gateway. Để tạo ra pCUC2::LSSmOrange, trình tự promoter CUC2 (3229 bp phía thượng nguồn của ATG) tiếp theo là trình tự mã hóa của mOrange dịch chuyển Stokes lớn (LSSmOrange)69 với tín hiệu định vị hạt nhân N7 và trình tự kết thúc phiên mã NOS được lắp ráp vào vector nhắm mục tiêu kanamycin pGreen bằng hệ thống tái tổ hợp 3 đoạn Gateway (Invitrogen). Vector nhị phân thực vật được đưa vào chủng Agrobacterium tumefaciens GV3101 và đưa vào lá Nicotiana benthamiana bằng phương pháp thẩm thấu Agrobacterium và vào Arabidopsis thaliana Col-0 bằng phương pháp nhúng hoa. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry và pCLV3::mCherry-NLS qmRGA được phân lập từ thế hệ F3 và F1 của các phép lai tương ứng.
Lai ghép RNA tại chỗ được thực hiện trên các đầu chồi dài khoảng 1 cm72, được thu thập và cố định ngay lập tức trong dung dịch FAA (3,7% formaldehyde, 5% axit axetic, 50% ethanol) đã được làm lạnh trước đến 4 °C. Sau 2 lần xử lý chân không 15 phút, dung dịch cố định được thay đổi và các mẫu được ủ qua đêm. Các cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 và RGL3 cùng các đầu dò antisense đối với vùng 3′-UTR của chúng được tổng hợp bằng cách sử dụng các mồi được hiển thị trong Bảng bổ sung 3 như mô tả bởi Rosier et al.73. Các đầu dò được gắn nhãn digoxigenin được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể digoxigenin (pha loãng 3000 lần; Roche, mã số sản phẩm: 11 093 274 910), và các lát cắt được nhuộm bằng dung dịch 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, pha loãng 250 lần)/nitroblue tetrazolium (NBT, pha loãng 200 lần).
Thời gian đăng bài: 10/02/2025