Trong nghiên cứu này, tác dụng kích thích của phương pháp điều trị kết hợp được xem xét.chất điều hòa sinh trưởng thực vậtẢnh hưởng của 2,4-D (2,4-D và kinetin) và các hạt nano oxit sắt (Fe₃O₄-NPs) đến quá trình hình thái học in vitro và sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp ở cây Hypericum perforatum L. đã được nghiên cứu. Phương pháp xử lý tối ưu [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] đã cải thiện đáng kể các thông số sinh trưởng của cây: chiều cao cây tăng 59,6%, chiều dài rễ tăng 114,0%, số chồi tăng 180,0% và trọng lượng tươi của mô sẹo tăng 198,3% so với nhóm đối chứng. Phương pháp xử lý kết hợp này cũng nâng cao hiệu quả tái sinh (50,85%) và tăng hàm lượng hypericin lên 66,6%. Phân tích GC-MS cho thấy hàm lượng cao của hyperoside, β-patholene và cetyl alcohol, chiếm 93,36% tổng diện tích đỉnh, trong khi hàm lượng tổng phenolic và flavonoid tăng tới 80,1%. Những kết quả này chỉ ra rằng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) và các hạt nano Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) tạo ra hiệu ứng hiệp đồng bằng cách kích thích sự hình thành cơ quan và tích lũy các hợp chất hoạt tính sinh học, đây là một chiến lược đầy hứa hẹn cho việc cải tiến công nghệ sinh học đối với cây thuốc.
Cây Hypericum perforatum L., còn được gọi là cây Hypericum perforatum, là một loại cây thân thảo lâu năm thuộc họ Hypericaceae có giá trị kinh tế.[1] Các thành phần hoạt tính sinh học tiềm năng của nó bao gồm tanin tự nhiên, xanthone, phloroglucinol, naphthalenedianthrone (hyperin và pseudohyperin), flavonoid, axit phenolic và tinh dầu.[2,3,4] Cây Hypericum perforatum có thể được nhân giống bằng các phương pháp truyền thống; tuy nhiên, tính thời vụ của các phương pháp truyền thống, tỷ lệ nảy mầm thấp và khả năng dễ mắc bệnh đã hạn chế tiềm năng canh tác quy mô lớn và sự hình thành liên tục các chất chuyển hóa thứ cấp của nó.[1,5,6]
Do đó, nuôi cấy mô trong ống nghiệm được coi là một phương pháp hiệu quả để nhân giống cây trồng nhanh chóng, bảo tồn nguồn gen và tăng năng suất các hợp chất dược liệu [7, 8]. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hình thái và cần thiết cho việc nuôi cấy mô sẹo và toàn bộ sinh vật trong ống nghiệm. Việc tối ưu hóa nồng độ và sự kết hợp của chúng là rất quan trọng để hoàn thành thành công các quá trình phát triển này [9]. Vì vậy, việc hiểu rõ thành phần và nồng độ thích hợp của các chất điều hòa là rất quan trọng để cải thiện khả năng sinh trưởng và tái sinh của cây Hypericum perforatum [10].
Các hạt nano oxit sắt (Fe₃O₄) là một loại hạt nano đã hoặc đang được phát triển cho nuôi cấy mô. Fe₃O₄ có đặc tính từ tính đáng kể, khả năng tương thích sinh học tốt và khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây trồng và giảm căng thẳng môi trường, do đó nó đã thu hút sự chú ý đáng kể trong thiết kế nuôi cấy mô. Các ứng dụng tiềm năng của các hạt nano này có thể bao gồm tối ưu hóa nuôi cấy trong ống nghiệm để thúc đẩy sự phân chia tế bào, cải thiện khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng và kích hoạt các enzyme chống oxy hóa [11].
Mặc dù các hạt nano đã cho thấy tác dụng thúc đẩy tốt đối với sự phát triển của cây trồng, nhưng các nghiên cứu về việc kết hợp ứng dụng hạt nano Fe₃O₄ và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được tối ưu hóa trên cây *H. perforatum* vẫn còn khan hiếm. Để lấp đầy khoảng trống kiến thức này, nghiên cứu này đã đánh giá tác động kết hợp của chúng đối với quá trình hình thái học in vitro và sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp nhằm cung cấp những hiểu biết mới để cải thiện các đặc tính của cây thuốc. Do đó, nghiên cứu này có hai mục tiêu: (1) tối ưu hóa nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật để thúc đẩy hiệu quả sự hình thành mô sẹo, tái sinh chồi và ra rễ in vitro; và (2) đánh giá tác động của hạt nano Fe₃O₄ đối với các thông số sinh trưởng in vitro. Kế hoạch trong tương lai bao gồm đánh giá tỷ lệ sống sót của cây tái sinh trong quá trình thích nghi (in vitro). Kết quả của nghiên cứu này được kỳ vọng sẽ cải thiện đáng kể hiệu quả vi nhân giống của *H. perforatum*, từ đó góp phần vào việc sử dụng bền vững và các ứng dụng công nghệ sinh học của loại cây thuốc quan trọng này.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu được các mẫu mô lá từ cây Hypericum perforatum (cây mẹ) trồng ngoài đồng. Các mẫu mô này được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong ống nghiệm. Trước khi nuôi cấy, lá được rửa kỹ dưới vòi nước cất chảy trong vài phút. Sau đó, bề mặt mẫu mô được khử trùng bằng cách ngâm trong ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo là ngâm trong dung dịch natri hypoclorit (NaOCl) 1,5% có chứa vài giọt Tween 20 trong 10 phút. Cuối cùng, các mẫu mô được rửa ba lần bằng nước cất vô trùng trước khi chuyển sang môi trường nuôi cấy tiếp theo.
Trong bốn tuần tiếp theo, các thông số tái sinh chồi được đo lường, bao gồm tỷ lệ tái sinh, số chồi trên mỗi mẫu cấy và chiều dài chồi. Khi các chồi tái sinh đạt chiều dài ít nhất 2 cm, chúng được chuyển sang môi trường nuôi cấy rễ bao gồm môi trường MS pha loãng một nửa, 0,5 mg/L axit indolebutyric (IBA) và 0,3% gôm guar. Quá trình nuôi cấy rễ tiếp tục trong ba tuần, trong thời gian đó tỷ lệ ra rễ, số lượng rễ và chiều dài rễ được đo lường. Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần, với 10 mẫu cấy được nuôi cấy cho mỗi lần lặp lại, thu được khoảng 30 mẫu cấy cho mỗi nghiệm thức.
Chiều cao cây được đo bằng thước kẻ, tính bằng centimet (cm), từ gốc cây đến ngọn lá cao nhất. Chiều dài rễ được đo bằng milimét (mm) ngay sau khi cẩn thận tách cây con và loại bỏ môi trường trồng. Số lượng chồi trên mỗi mẫu cấy được đếm trực tiếp trên từng cây. Số lượng đốm đen trên lá, còn gọi là nốt sần, được đo bằng mắt thường. Những nốt sần đen này được cho là các tuyến chứa hypericin, hay còn gọi là các đốm oxy hóa, và được sử dụng như một chỉ thị sinh lý về phản ứng của cây đối với phương pháp xử lý. Sau khi loại bỏ toàn bộ môi trường trồng, trọng lượng tươi của cây con được đo bằng cân điện tử có độ chính xác đến miligam (mg).
Phương pháp tính toán tỷ lệ hình thành mô sẹo như sau: sau khi nuôi cấy mẫu cấy trong môi trường chứa các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau (kinase, 2,4-D và Fe3O4) trong bốn tuần, đếm số lượng mẫu cấy có khả năng hình thành mô sẹo. Công thức tính toán tỷ lệ hình thành mô sẹo như sau:
Mỗi phương pháp điều trị được lặp lại ba lần, với ít nhất 10 mẫu mô được kiểm tra trong mỗi lần lặp lại.
Tỷ lệ tái sinh phản ánh tỷ lệ mô sẹo hoàn thành thành công quá trình phân hóa chồi sau giai đoạn hình thành mô sẹo. Chỉ số này thể hiện khả năng của mô sẹo chuyển hóa thành mô phân hóa và phát triển thành các cơ quan thực vật mới.
Hệ số ra rễ là tỷ lệ giữa số cành có khả năng ra rễ và tổng số cành. Chỉ số này phản ánh sự thành công của giai đoạn ra rễ, điều rất quan trọng trong vi nhân giống và nhân giống cây trồng, vì khả năng ra rễ tốt giúp cây con sống sót tốt hơn trong điều kiện sinh trưởng.
Các hợp chất hypericin được chiết xuất bằng methanol 90%. Năm mươi mg nguyên liệu thực vật khô được thêm vào 1 ml methanol và được siêu âm trong 20 phút ở tần số 30 kHz trong máy siêu âm (mẫu A5120-3YJ) ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau khi siêu âm, mẫu được ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch nổi được thu thập và độ hấp thụ của hypericin được đo ở bước sóng 592 nm bằng máy quang phổ Plus-3000 S theo phương pháp được mô tả bởi Conceiçao et al. [14].
Hầu hết các phương pháp xử lý bằng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) và hạt nano oxit sắt (Fe₃O₄-NP) đều không gây ra sự hình thành nốt đen trên lá chồi tái sinh. Không có nốt nào được quan sát thấy trong bất kỳ phương pháp xử lý nào với 0,5 hoặc 1 mg/L 2,4-D, 0,5 hoặc 1 mg/L kinetin, hoặc 1, 2, hoặc 4 mg/L hạt nano oxit sắt. Một vài sự kết hợp cho thấy sự gia tăng nhẹ trong sự phát triển nốt (nhưng không có ý nghĩa thống kê) ở nồng độ kinetin và/hoặc hạt nano oxit sắt cao hơn, chẳng hạn như sự kết hợp của 2,4-D (0,5–2 mg/L) với kinetin (1–1,5 mg/L) và hạt nano oxit sắt (2–4 mg/L). Các kết quả này được thể hiện trong Hình 2. Các nốt đen đại diện cho các tuyến giàu hypericin, cả tự nhiên và có lợi. Trong nghiên cứu này, các nốt đen chủ yếu liên quan đến hiện tượng hóa nâu mô, cho thấy môi trường thuận lợi cho sự tích lũy hypericin. Việc điều trị bằng 2,4-D, kinetin và các hạt nano Fe₃O₄ đã thúc đẩy sự phát triển của mô sẹo, giảm hiện tượng nâu hóa và tăng hàm lượng diệp lục, cho thấy chức năng trao đổi chất được cải thiện và khả năng giảm tổn thương oxy hóa [37]. Nghiên cứu này đã đánh giá tác dụng của kinetin kết hợp với 2,4-D và các hạt nano Fe₃O₄ đối với sự tăng trưởng và phát triển của mô sẹo cây Hypericum perforatum (Hình 3a–g). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hạt nano Fe₃O₄ có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn [38, 39] và, khi được sử dụng kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, có thể kích thích cơ chế phòng vệ của thực vật và giảm các chỉ số căng thẳng tế bào [18]. Mặc dù quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp được điều chỉnh về mặt di truyền, nhưng sản lượng thực tế của chúng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường. Những thay đổi về trao đổi chất và hình thái có thể ảnh hưởng đến mức độ chất chuyển hóa thứ cấp bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của các gen thực vật cụ thể và phản ứng với các yếu tố môi trường. Hơn nữa, các chất cảm ứng có thể kích hoạt các gen mới, từ đó kích thích hoạt động của enzyme, cuối cùng kích hoạt nhiều con đường sinh tổng hợp và dẫn đến sự hình thành các chất chuyển hóa thứ cấp. Thêm vào đó, một nghiên cứu khác cho thấy việc giảm bóng râm làm tăng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, do đó làm tăng nhiệt độ ban ngày trong môi trường sống tự nhiên của *Hypericum perforatum*, điều này cũng góp phần làm tăng sản lượng hypericin. Dựa trên những dữ liệu này, nghiên cứu này đã điều tra vai trò của các hạt nano sắt như là các chất cảm ứng tiềm năng trong nuôi cấy mô. Kết quả cho thấy các hạt nano này có thể kích hoạt các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp hesperidin thông qua kích thích enzyme, dẫn đến sự tích lũy hợp chất này tăng lên (Hình 2). Do đó, so với các cây trồng trong điều kiện tự nhiên, có thể lập luận rằng việc sản xuất các hợp chất như vậy trong cơ thể sống cũng có thể được tăng cường khi kết hợp căng thẳng vừa phải với việc kích hoạt các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Các phương pháp điều trị kết hợp thường có tác động tích cực đến tỷ lệ tái sinh, nhưng trong một số trường hợp, tác động này bị suy yếu. Đáng chú ý, việc điều trị bằng 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinase và các nồng độ khác nhau có thể làm tăng tỷ lệ tái sinh một cách độc lập và đáng kể lên 50,85% so với nhóm đối chứng (Hình 4c). Những kết quả này cho thấy sự kết hợp cụ thể của các nanohormone có thể hoạt động hiệp đồng để thúc đẩy sự phát triển của cây và sản xuất chất chuyển hóa, điều này có ý nghĩa rất lớn đối với nuôi cấy mô cây thuốc. Palmer và Keller [50] đã chỉ ra rằng việc điều trị bằng 2,4-D có thể độc lập gây ra sự hình thành mô sẹo ở St. perforatum, trong khi việc bổ sung kinase làm tăng đáng kể sự hình thành mô sẹo và tái sinh. Hiệu ứng này là do sự cải thiện cân bằng hormone và kích thích phân chia tế bào. Bal et al. [51] đã phát hiện ra rằng việc điều trị bằng Fe₃O₄-NP có thể độc lập tăng cường chức năng của các enzyme chống oxy hóa, do đó thúc đẩy sự phát triển rễ ở St. perforatum. Môi trường nuôi cấy chứa các hạt nano Fe₃O₄ ở nồng độ 0,5 mg/L, 1 mg/L và 1,5 mg/L đã cải thiện tỷ lệ tái sinh của cây lanh [52]. Việc sử dụng kinetin, 2,4-dichlorobenzothiazolinone và các hạt nano Fe₃O₄ đã cải thiện đáng kể tỷ lệ hình thành mô sẹo và rễ, tuy nhiên, cần phải xem xét các tác dụng phụ tiềm tàng của việc sử dụng các hormone này để tái sinh trong ống nghiệm. Ví dụ, việc sử dụng lâu dài hoặc ở nồng độ cao 2,4-dichlorobenzothiazolinone hoặc kinetin có thể dẫn đến biến dị dòng vô tính soma, stress oxy hóa, hình thái mô sẹo bất thường hoặc thủy tinh hóa. Do đó, tỷ lệ tái sinh cao không nhất thiết dự đoán được tính ổn định di truyền. Tất cả các cây được tái sinh nên được đánh giá bằng cách sử dụng các dấu hiệu phân tử (ví dụ: RAPD, ISSR, AFLP) hoặc phân tích tế bào học để xác định tính đồng nhất và sự tương đồng của chúng với cây sống [53,54,55].
Nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh rằng việc sử dụng kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (2,4-D và kinetin) với các hạt nano Fe₃O₄ có thể tăng cường quá trình hình thái học và tích lũy các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học quan trọng (bao gồm hypericin và hyperoside) trong cây *Hypericum perforatum*. Chế độ điều trị tối ưu (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) không chỉ tối đa hóa sự hình thành mô sẹo, quá trình hình thành cơ quan và năng suất chất chuyển hóa thứ cấp mà còn thể hiện tác dụng kích thích nhẹ, có khả năng cải thiện khả năng chịu stress và giá trị dược liệu của cây. Sự kết hợp giữa công nghệ nano và nuôi cấy mô thực vật cung cấp một nền tảng bền vững và hiệu quả cho sản xuất quy mô lớn các hợp chất dược liệu trong ống nghiệm. Những kết quả này mở đường cho các ứng dụng công nghiệp và nghiên cứu trong tương lai về cơ chế phân tử, tối ưu hóa liều lượng và độ chính xác di truyền, từ đó liên kết nghiên cứu cơ bản về cây thuốc với công nghệ sinh học thực tiễn.
Thời gian đăng bài: 12/12/2025