Thuốc diệt giun sán N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) đã được báo cáo là ức chế AChE (acetylcholinesterase) và có đặc tính gây ung thư tiềm ẩn do quá trình mạch hóa quá mức. Trong bài báo này, chúng tôi chỉ ra rằng DEET kích thích cụ thể các tế bào nội mô thúc đẩy quá trình hình thành mạch máu, do đó làm tăng sự phát triển của khối u. DEET kích hoạt các quá trình tế bào dẫn đến quá trình hình thành mạch máu, bao gồm sự tăng sinh, di cư và bám dính. Điều này có liên quan đến việc tăng sản xuất NO và biểu hiện VEGF trong các tế bào nội mô. Việc làm im lặng M3 hoặc sử dụng chất ức chế M3 dược lý đã xóa bỏ tất cả các tác động này, cho thấy quá trình hình thành mạch máu do DEET gây ra nhạy cảm với M3. Các thí nghiệm liên quan đến tín hiệu canxi trong các tế bào nội mô và HEK biểu hiện quá mức thụ thể M3, cũng như các nghiên cứu liên kết và gắn kết, chỉ ra rằng DEET hoạt động như một chất điều biến dị lập thể của thụ thể M3. Hơn nữa, DEET ức chế AChE, do đó làm tăng khả dụng sinh học của acetylcholine và sự liên kết của nó với thụ thể M3, và tăng cường các tác dụng tiền sinh mạch thông qua điều hòa dị lập thể.
EC chính được phân lập từ động mạch chủ của chuột Thụy Sĩ. Phương pháp chiết xuất được điều chỉnh từ giao thức Kobayashi 26. EC chuột được nuôi cấy trong môi trường EBM-2 bổ sung 5% FBS bất hoạt bằng nhiệt cho đến lần truyền thứ tư.
Tác động của hai nồng độ DEET lên sự tăng sinh của HUVEC, U87MG hoặc BF16F10 đã được phân tích bằng Bộ xét nghiệm tăng sinh tế bào CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Tóm lại, 5,103 tế bào trên mỗi giếng được gieo vào một đĩa 96 giếng, để bám qua đêm, sau đó xử lý bằng DEET trong 24 giờ. Sau khi loại bỏ môi trường tăng trưởng, thêm dung dịch liên kết thuốc nhuộm vào từng giếng của đĩa vi mô và ủ tế bào ở 37 °C trong 30 phút. Mức độ huỳnh quang được xác định bằng đầu đọc đĩa vi mô đa chế độ Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Đức) được trang bị bộ lọc kích thích 485 nm và bộ lọc phát xạ 530 nm.
HUVEC được gieo vào các đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào trên một giếng. Các tế bào được xử lý bằng DEET trong 24 giờ. Khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm MTT đo màu (Sigma-Aldrich, M5655). Các giá trị mật độ quang học được thu được trên đầu đọc vi mạch đa chế độ (Mithras LB940) ở bước sóng 570 nm.
Tác dụng của DEET đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng các xét nghiệm hình thành mạch máu trong ống nghiệm. Xử lý bằng DEET 10-8 M hoặc 10-5 M làm tăng sự hình thành chiều dài mao mạch ở HUVEC (Hình 1a, b, các thanh màu trắng). So với nhóm đối chứng, xử lý bằng nồng độ DEET trong khoảng từ 10-14 đến 10-5 M cho thấy chiều dài mao mạch đạt đến mức ổn định ở nồng độ DEET 10-8 M (Hình bổ sung S2). Không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy trong tác dụng hình thành mạch máu trong ống nghiệm của HUVEC được xử lý bằng DEET trong phạm vi nồng độ 10-8 M và 10-5 M.
Để xác định tác dụng của DEET đối với quá trình tân mạch hóa, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu tân mạch hóa in vivo. Sau 14 ngày, những con chuột được tiêm tế bào nội mô được nuôi cấy trước bằng 10-8 M hoặc 10-5 M DEET cho thấy hàm lượng hemoglobin tăng đáng kể (Hình 1c, các thanh màu trắng).
Hơn nữa, quá trình tân mạch hóa do DEET gây ra đã được nghiên cứu ở những con chuột mang ghép dị loại U87MG được tiêm DEET hàng ngày (ip) với liều lượng được biết là gây ra nồng độ trong huyết tương là 10-5 M, mức bình thường ở người tiếp xúc. trong 23. Các khối u có thể phát hiện được (tức là các khối u >100 mm3) đã được quan sát thấy 14 ngày sau khi tiêm tế bào U87MG vào chuột. Vào ngày 28, sự phát triển của khối u được tăng cường đáng kể ở những con chuột được điều trị bằng DEET so với những con chuột đối chứng (Hình 1d, hình vuông). Hơn nữa, nhuộm CD31 các khối u cho thấy DEET làm tăng đáng kể diện tích mao mạch nhưng không làm tăng mật độ mạch máu nhỏ. (Hình 1e–g).
Để xác định vai trò của thụ thể muscarinic trong sự tăng sinh do DETA gây ra, DETA 10-8 M hoặc 10-5 M khi có pFHHSiD (10-7 M, chất đối kháng thụ thể M3 chọn lọc) đã được sử dụng. Điều trị HUVEC. pFHHSiD đã chặn hoàn toàn các đặc tính tăng sinh của DETA ở mọi nồng độ (Bảng 1).
Trong những điều kiện này, chúng tôi cũng kiểm tra xem DEET có làm tăng chiều dài mao mạch trong các tế bào HUVEC hay không. Tương tự như vậy, pFHHSiD ngăn ngừa đáng kể chiều dài mao mạch do DEET gây ra (Hình 1a, b, thanh màu xám). Hơn nữa, các thí nghiệm tương tự đã được thực hiện với M3 siRNA. Mặc dù siRNA kiểm soát không hiệu quả trong việc thúc đẩy sự hình thành mao mạch, việc làm im lặng thụ thể muscarinic M3 đã xóa bỏ khả năng làm tăng chiều dài mao mạch của DEET (Hình 1a, b, thanh màu đen).
Hơn nữa, cả quá trình mạch hóa do DEET 10-8 M hoặc 10-5 M gây ra trong ống nghiệm và quá trình tân mạch hóa trong cơ thể sống đều bị pFHHSiD chặn hoàn toàn (Hình 1c, d, vòng tròn). Những kết quả này chỉ ra rằng DEET thúc đẩy quá trình hình thành mạch máu thông qua một con đường nhạy cảm với các chất đối kháng thụ thể M3 chọn lọc hoặc siRNA M3.
AChE là mục tiêu phân tử của DEET. Các loại thuốc như donepezil, hoạt động như chất ức chế AChE, có thể kích thích quá trình hình thành mạch máu EC trong ống nghiệm và trong các mô hình thiếu máu cục bộ chi sau của chuột14. Chúng tôi đã thử nghiệm tác dụng của hai nồng độ DEET lên hoạt động của enzyme AChE trong HUVEC. Nồng độ DEET thấp (10-8 M) và cao (10-5 M) làm giảm hoạt động của AChE nội mô so với điều kiện kiểm soát (Hình 2).
Cả hai nồng độ DEET (10-8 M và 10-5 M) đều làm giảm hoạt động acetylcholinesterase trên HUVEC. BW284c51 (10-5 M) được sử dụng làm đối chứng cho chất ức chế acetylcholinesterase. Kết quả được thể hiện dưới dạng phần trăm hoạt động AChE trên HUVEC được xử lý bằng hai nồng độ DEET so với các tế bào được xử lý bằng chất mang. Các giá trị được thể hiện dưới dạng trung bình ± SEM của sáu thí nghiệm độc lập. *p < 0,05 so với đối chứng (kiểm tra so sánh bội Kruskal-Wallis và Dunn).
Nitric oxide (NO) tham gia vào quá trình hình thành mạch máu 33, do đó, quá trình sản xuất NO trong các HUVEC được kích thích bằng DEET đã được nghiên cứu. Quá trình sản xuất NO nội mô được xử lý bằng DEET tăng lên so với các tế bào đối chứng, nhưng chỉ đạt ý nghĩa ở liều 10-8 M (Hình 3c). Để xác định những thay đổi về mặt phân tử kiểm soát quá trình sản xuất NO do DEET gây ra, biểu hiện và hoạt hóa eNOS đã được phân tích bằng phương pháp Western blotting. Mặc dù quá trình xử lý bằng DEET không làm thay đổi biểu hiện eNOS, nhưng nó làm tăng đáng kể quá trình phosphoryl hóa eNOS tại vị trí hoạt hóa của nó (Ser-1177) trong khi làm giảm vị trí ức chế của nó (Thr-495) so với các tế bào chưa được xử lý trong quá trình phosphoryl hóa eNOS (Hình 3d). Hơn nữa, tỷ lệ eNOS đã phosphoryl hóa tại vị trí hoạt hóa và vị trí ức chế đã được tính toán sau khi chuẩn hóa lượng eNOS đã phosphoryl hóa so với tổng lượng enzyme. Tỷ lệ này tăng đáng kể ở các HUVEC được xử lý bằng từng nồng độ DEET so với các tế bào chưa được xử lý (Hình 3d).
Cuối cùng, biểu hiện của VEGF, một trong những yếu tố chính hình thành mạch máu, đã được phân tích bằng phương pháp Western blotting. DEET làm tăng đáng kể biểu hiện VEGF, trong khi pFHHSiD chặn hoàn toàn biểu hiện này.
Vì tác dụng của DEET nhạy cảm với cả sự phong tỏa dược lý và sự điều hòa giảm thụ thể M3, chúng tôi đã kiểm tra giả thuyết rằng DEET có thể tăng cường tín hiệu canxi. Đáng ngạc nhiên là DEET không làm tăng canxi tế bào chất ở HUVEC (dữ liệu không được hiển thị) và HEK/M3 (Hình 4a, b) đối với cả hai nồng độ được sử dụng.
Thời gian đăng: 30-12-2024