Thuốc tẩy giun N,N-diethyl-m-toluamide (DEETDEET (một loại thuốc kháng sinh) được báo cáo là có khả năng ức chế AChE (acetylcholinesterase) và có đặc tính gây ung thư tiềm tàng do sự hình thành mạch máu quá mức. Trong bài báo này, chúng tôi chứng minh rằng DEET kích thích đặc hiệu các tế bào nội mô thúc đẩy quá trình tạo mạch máu, từ đó làm tăng sự phát triển của khối u. DEET kích hoạt các quá trình tế bào dẫn đến tạo mạch máu, bao gồm sự tăng sinh, di chuyển và bám dính. Điều này liên quan đến việc tăng sản xuất NO và biểu hiện VEGF trong các tế bào nội mô. Việc ức chế M3 hoặc sử dụng các chất ức chế dược lý M3 đã loại bỏ tất cả các tác dụng này, cho thấy rằng quá trình tạo mạch máu do DEET gây ra nhạy cảm với M3. Các thí nghiệm liên quan đến tín hiệu canxi trong tế bào nội mô và tế bào HEK biểu hiện quá mức thụ thể M3, cũng như các nghiên cứu về liên kết và ghép nối, cho thấy DEET hoạt động như một chất điều biến dị lập thể của thụ thể M3. Hơn nữa, DEET ức chế AChE, do đó làm tăng khả dụng sinh học của acetylcholine và sự liên kết của nó với thụ thể M3, và tăng cường các tác dụng thúc đẩy tạo mạch máu thông qua điều hòa dị lập thể.
Các tế bào nội mô (EC) nguyên phát được phân lập từ động mạch chủ của chuột Thụy Sĩ. Phương pháp chiết xuất được điều chỉnh từ quy trình Kobayashi 26. Các tế bào nội mô chuột được nuôi cấy trong môi trường EBM-2 bổ sung 5% FBS bất hoạt bằng nhiệt cho đến lần cấy chuyển thứ tư.
Ảnh hưởng của hai nồng độ DEET lên sự tăng sinh của tế bào HUVEC, U87MG hoặc BF16F10 đã được phân tích bằng cách sử dụng bộ kit xét nghiệm tăng sinh tế bào CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Tóm lại, 5.103 tế bào mỗi giếng được gieo vào đĩa 96 giếng, để cho bám dính qua đêm, sau đó được xử lý bằng DEET trong 24 giờ. Sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy, thêm dung dịch gắn kết thuốc nhuộm vào mỗi giếng của đĩa vi giếng và ủ tế bào ở 37 °C trong 30 phút. Mức độ huỳnh quang được xác định bằng máy đọc đĩa vi giếng đa chế độ Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Đức) được trang bị bộ lọc kích thích 485 nm và bộ lọc phát xạ 530 nm.
Tế bào HUVEC được cấy vào đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng. Các tế bào được xử lý bằng DEET trong 24 giờ. Khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng phương pháp đo màu MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Giá trị mật độ quang được thu được trên máy đọc vi phiến đa chế độ (Mithras LB940) ở bước sóng 570 nm.
Tác dụng của DEET được nghiên cứu bằng phương pháp thử nghiệm tạo mạch máu trong ống nghiệm. Điều trị bằng DEET ở nồng độ 10⁻⁸ M hoặc 10⁻⁵ M làm tăng chiều dài mao mạch trong tế bào nội mô mạch máu rốn người (HUVECs) (Hình 1a, b, cột màu trắng). So với nhóm đối chứng, điều trị bằng DEET ở nồng độ từ 10⁻¹⁴ đến 10⁻⁵ M cho thấy chiều dài mao mạch đạt đến mức bão hòa ở nồng độ 10⁻⁸ M DEET (Hình bổ sung S2). Không có sự khác biệt đáng kể nào được tìm thấy trong tác dụng thúc đẩy tạo mạch máu trong ống nghiệm của HUVECs được xử lý bằng DEET ở nồng độ từ 10⁻⁸ M và 10⁻⁵ M.
Để xác định tác dụng của DEET đối với sự hình thành mạch máu mới, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu hình thành mạch máu mới trên động vật sống. Sau 14 ngày, chuột được tiêm tế bào nội mô đã được nuôi cấy trước với 10-8 M hoặc 10-5 M DEET cho thấy sự gia tăng đáng kể hàm lượng hemoglobin (Hình 1c, các cột màu trắng).
Hơn nữa, hiện tượng tân tạo mạch máu do DEET gây ra đã được nghiên cứu trên chuột mang khối u ghép U87MG được tiêm DEET hàng ngày (tiêm phúc mạc) với liều lượng được biết là gây ra nồng độ trong huyết tương là 10-5 M, mức bình thường ở người tiếp xúc. 23. Các khối u có thể phát hiện được (tức là khối u >100 mm3) đã được quan sát thấy 14 ngày sau khi tiêm tế bào U87MG vào chuột. Vào ngày thứ 28, sự phát triển của khối u được tăng cường đáng kể ở chuột được điều trị bằng DEET so với chuột đối chứng (Hình 1d, ô vuông). Hơn nữa, nhuộm CD31 của khối u cho thấy DEET làm tăng đáng kể diện tích mao mạch nhưng không làm tăng mật độ vi mạch. (Hình 1e–g).
Để xác định vai trò của thụ thể muscarinic trong sự tăng sinh do DETA gây ra, người ta đã sử dụng DETA ở nồng độ 10-8 M hoặc 10-5 M khi có mặt pFHHSiD (10-7 M, một chất đối kháng thụ thể M3 chọn lọc). Điều trị HUVEC. pFHHSiD đã ngăn chặn hoàn toàn các đặc tính tăng sinh của DETA ở tất cả các nồng độ (Bảng 1).
Trong những điều kiện này, chúng tôi cũng đã kiểm tra xem DEET có làm tăng chiều dài mao mạch trong tế bào HUVEC hay không. Tương tự, pFHHSiD đã ngăn chặn đáng kể sự gia tăng chiều dài mao mạch do DEET gây ra (Hình 1a, b, các cột màu xám). Hơn nữa, các thí nghiệm tương tự đã được thực hiện với siRNA M3. Mặc dù siRNA đối chứng không hiệu quả trong việc thúc đẩy sự hình thành mao mạch, nhưng việc ức chế thụ thể muscarinic M3 đã loại bỏ khả năng của DEET trong việc làm tăng chiều dài mao mạch (Hình 1a, b, các cột màu đen).
Hơn nữa, cả quá trình hình thành mạch máu trong ống nghiệm và quá trình tân tạo mạch máu trong cơ thể sống do DEET gây ra ở nồng độ 10-8 M hoặc 10-5 M đều bị ức chế hoàn toàn bởi pFHHSiD (Hình 1c, d, vòng tròn). Những kết quả này cho thấy DEET thúc đẩy quá trình tạo mạch máu thông qua một con đường nhạy cảm với các chất đối kháng thụ thể M3 chọn lọc hoặc siRNA M3.
AChE là mục tiêu phân tử của DEET. Các loại thuốc như donepezil, hoạt động như chất ức chế AChE, có thể kích thích sự hình thành mạch máu EC trong ống nghiệm và trong mô hình thiếu máu cục bộ chi sau ở chuột14. Chúng tôi đã thử nghiệm tác dụng của hai nồng độ DEET lên hoạt tính enzyme AChE trong HUVEC. Nồng độ DEET thấp (10-8 M) và cao (10-5 M) làm giảm hoạt tính AChE nội mô so với điều kiện đối chứng (Hình 2).
Cả hai nồng độ DEET (10⁻⁸ M và 10⁻⁵ M) đều làm giảm hoạt tính acetylcholinesterase trên tế bào HUVEC. BW284c51 (10⁻⁵ M) được sử dụng làm đối chứng cho các chất ức chế acetylcholinesterase. Kết quả được biểu thị bằng phần trăm hoạt tính AChE trên tế bào HUVEC được xử lý với hai nồng độ DEET so với các tế bào được xử lý bằng dung môi. Các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM) của sáu thí nghiệm độc lập. *p < 0,05 so với nhóm đối chứng (kiểm định Kruskal-Wallis và kiểm định so sánh đa cặp Dunn).
Nitric oxide (NO) tham gia vào quá trình tạo mạch máu 33, do đó, quá trình sản xuất NO trong tế bào HUVEC được kích thích bằng DEET đã được nghiên cứu. Sản xuất NO nội mô được xử lý bằng DEET tăng lên so với các tế bào đối chứng, nhưng chỉ đạt mức ý nghĩa thống kê ở liều 10-8 M (Hình 3c). Để xác định những thay đổi phân tử kiểm soát quá trình sản xuất NO do DEET gây ra, biểu hiện và hoạt hóa eNOS đã được phân tích bằng phương pháp Western blotting. Mặc dù việc điều trị bằng DEET không làm thay đổi biểu hiện eNOS, nhưng nó đã làm tăng đáng kể quá trình phosphoryl hóa eNOS tại vị trí hoạt hóa (Ser-1177) đồng thời làm giảm vị trí ức chế (Thr-495) so với các tế bào không được xử lý trong quá trình phosphoryl hóa eNOS (Hình 3d). Hơn nữa, tỷ lệ eNOS được phosphoryl hóa tại vị trí hoạt hóa và vị trí ức chế đã được tính toán sau khi chuẩn hóa lượng eNOS được phosphoryl hóa so với tổng lượng enzyme. Tỷ lệ này tăng lên đáng kể ở các tế bào HUVEC được xử lý với mỗi nồng độ DEET so với các tế bào không được xử lý (Hình 3d).
Cuối cùng, sự biểu hiện của VEGF, một trong những yếu tố thúc đẩy hình thành mạch máu chính, đã được phân tích bằng phương pháp Western blotting. DEET làm tăng đáng kể sự biểu hiện của VEGF, trong khi pFHHSiD ngăn chặn hoàn toàn sự biểu hiện này.
Vì tác dụng của DEET nhạy cảm với cả sự phong tỏa dược lý và sự điều hòa giảm của thụ thể M3, chúng tôi đã kiểm tra giả thuyết rằng DEET có thể tăng cường tín hiệu canxi. Thật ngạc nhiên, DEET không làm tăng lượng canxi trong tế bào chất ở HUVEC (dữ liệu không được hiển thị) và HEK/M3 (Hình 4a, b) ở cả hai nồng độ được sử dụng.
Thời gian đăng bài: 30/12/2024