Thuốc trừ sâu đóng vai trò quan trọng trong việc giải quyết tình trạng thiếu lương thực toàn cầu và chống lại các bệnh truyền nhiễm ở người do côn trùng gây ra. Tuy nhiên, vấn đề kháng thuốc trừ sâu ngày càng gia tăng đòi hỏi phải khẩn cấp tìm ra các hợp chất mới nhắm vào các mục tiêu chưa được khai thác. Các kênh thụ thể tiềm năng thoáng qua (TRPV) của côn trùng—Nanzhong (Nan) và không hoạt động (Iav)—có thể tạo thành các kênh dị loại (Nan-Iav) và định vị tại các cơ quan cảm thụ cơ học điều hòa hướng trọng lực, thính giác và cảm thụ bản thể ở côn trùng. Một số thuốc trừ sâu, chẳng hạn như aphidopyrrolidone (AP), nhắm mục tiêu vào Nan-Iav thông qua các cơ chế chưa được biết rõ. AP có hiệu quả chống lại côn trùng chích hút (bộ Hemiptera), ngăn chặn việc hút máu bằng cách phá vỡ chức năng của các sợi tơ. AP chỉ có thể liên kết với Nan, nhưng chỉ Nan-Iav mới có thể tương tác với các chất chủ vận, bao gồm nicotinamide nội sinh (NAM), do đó thể hiện hoạt động của kênh. Mặc dù Nan-Iav có tiềm năng là mục tiêu của thuốc trừ sâu, nhưng người ta biết rất ít về cấu trúc kênh, các vị trí liên kết điều hòa và sự điều hòa phụ thuộc vào Ca2+ của nó, cản trở sự phát triển thuốc trừ sâu hơn nữa. Trong nghiên cứu này, kính hiển vi điện tử đông lạnh được sử dụng để xác định cấu trúc của Nan-Iav trong côn trùng thuộc bộ Hemiptera ở trạng thái không có phối tử calmodulin, cũng như với AP và NAM tại ranh giới của miền tế bào chất lặp lại ankyrin (ARD). Điều đáng ngạc nhiên là chúng tôi phát hiện ra rằng bản thân protein Nan có thể tạo thành một pentamer, được ổn định bởi các tương tác ARD do AP làm trung gian. Nghiên cứu này tiết lộ các tương tác phân tử giữa thuốc trừ sâu và chất chủ vận với Nan-Iav, làm nổi bật tầm quan trọng của ARD trong chức năng và sự lắp ráp kênh, đồng thời khám phá cơ chế điều hòa Ca2+.
Trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu ngày càng nghiêm trọng, tình trạng an ninh lương thực toàn cầu xấu đi là một trong những thách thức lớn của thế kỷ 21, với những hậu quả dây chuyền đối với xã hội.1,2Báo cáo Tình trạng An ninh Lương thực và Dinh dưỡng trên Thế giới năm 2023 (SOFI) của Tổ chức Y tế Thế giới ước tính rằng khoảng 2,33 tỷ người trên toàn thế giới đang phải đối mặt với tình trạng mất an ninh lương thực từ mức độ trung bình đến nghiêm trọng, một vấn đề tồn tại từ lâu.3,4Thật không may, ước tính hàng năm có từ 20% đến 30% hoặc hơn sản lượng cây trồng bị mất do sâu bệnh, và hiện tượng nóng lên toàn cầu được dự đoán sẽ làm trầm trọng thêm tình trạng kháng thuốc của sâu bệnh và tính dễ bị tổn thương của cây trồng.4,5,6,7,8Việc phát triển thuốc trừ sâu rất quan trọng không chỉ để bảo vệ cây trồng khỏi sâu bệnh và giảm sự lây lan của các mầm bệnh do côn trùng truyền bệnh, mà còn để chống lại các bệnh ở người do côn trùng truyền bệnh như sốt xuất huyết, sốt rét và bệnh Chagas, những bệnh ngày càng kháng thuốc trừ sâu.5,9,10,11
Trong số các mục tiêu chính của thuốc trừ sâu gây độc thần kinh, kênh TRPV dị tứ phân tử Nanchung (Nan)-Không hoạt động (Iav) đại diện cho một nhóm mục tiêu thuốc trừ sâu chỉ được phát hiện trong thập kỷ qua, bao gồm cả các loại thuốc trừ sâu thương mại như imidacloprid và pyraclostrobin.12, 13, 14Thuốc trừ sâu bán tổng hợp aphidopyrrolifen (AP) là một sản phẩm mới được phát triển và thương mại hóa gần đây, thành phần chính của nó là hoạt chất thuốc trừ sâu Inscalis®, chất này liên kết với AP ở mức hoạt tính dưới nanomolar.15AP có độc tính cấp tính thấp đối với các loài thụ phấn, côn trùng có lợi và các sinh vật không phải mục tiêu khác, và khi được sử dụng theo hướng dẫn trên nhãn, nó có thể làm giảm áp lực kháng thuốc đối với các loại thuốc trừ sâu khác.16, 17, 18Nan và Iav phân bố rộng rãi trong các loài côn trùng, chỉ được biểu hiện đồng thời trong các tế bào thần kinh thụ thể căng dây ở râu và chi, và rất quan trọng đối với thính giác, cảm nhận trọng lực và cảm thụ bản thể.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidacloprid và pyraclostrobin kích thích phức hợp Nan-Iav thông qua một cơ chế độc đáo, cuối cùng ức chế quá trình truyền tín hiệu cảm thụ bản thể.13, 16, 23Ở các loài côn trùng chích hút (bộ Hemiptera) như rệp và ruồi trắng, mất khả năng cảm nhận vị trí cơ thể làm suy giảm khả năng kiếm ăn, cuối cùng dẫn đến tử vong.13,24Điều thú vị là, AP thể hiện ái lực cao với phức hợp Nan-Iav và ái lực thấp với Nan đơn độc. Sự liên kết của AP với Nan-Iav tạo ra dòng điện, nhưng sự liên kết với Nan đơn độc không kích thích hoạt động của kênh. Bản thân Iav không liên kết với AP.16Điều này cho thấy Nan và Iav có thể liên kết để tạo thành các phức hợp kênh Nan-Iav khác nhau (ví dụ: với tỷ lệ thành phần khác nhau hoặc các sắp xếp khác nhau trong cùng một tỷ lệ thành phần) hoặc AP có thể liên kết với nhiều vị trí. Hơn nữa, chất chủ vận tự nhiên nicotinamide (NAM) liên kết với Nan-Iav của Drosophila với ái lực micromolar, thể hiện các tác dụng tương tự như của rệp (AP) trong ống nghiệm.16,25và ức chế sự sinh sản và hút chất dinh dưỡng của rệp, cuối cùng dẫn đến cái chết của chúng.25,26Những dữ liệu này đặt ra nhiều câu hỏi. Ví dụ, vẫn chưa rõ cơ chế hình thành dị dimer Nan-Iav, các vị trí liên kết nào được sử dụng để điều chỉnh các phân tử nhỏ, và làm thế nào các phân tử nhỏ này điều chỉnh chức năng kênh bằng cách ức chế cảm thụ bản thể. Hơn nữa, lý do tại sao bản thân Nan không hoạt động và có ái lực thấp với AP, trong khi dị dimer Nan-Iav lại hoạt động và liên kết với AP với ái lực cao hơn, vẫn chưa rõ. Cuối cùng, người ta biết rất ít về sự điều hòa chức năng Nan-Iav phụ thuộc vào Ca2+ và cách nó được tích hợp vào các quá trình truyền tín hiệu thần kinh.. 13,21
Trong nghiên cứu này, bằng cách kết hợp kính hiển vi điện tử đông lạnh, điện sinh lý học và kỹ thuật liên kết phóng xạ, chúng tôi đã làm sáng tỏ quá trình lắp ráp Nan-Iav và cơ chế liên kết của nó với các chất điều hòa phân tử nhỏ. Hơn nữa, chúng tôi đã phát hiện calmodulin (CaM) liên kết thường trực với Iav và các pentamer Nan được ổn định bởi AP. Những kết quả này cung cấp những hiểu biết quan trọng về sự điều hòa ion canxi trong kênh, quá trình lắp ráp kênh và các yếu tố quyết định ái lực liên kết phối tử. Quan trọng hơn, chúng tôi đã xác nhận rằng ARD đóng vai trò trung tâm trong các quá trình này. Nghiên cứu của chúng tôi về các kênh côn trùng hoàn chỉnh liên kết với các thuốc trừ sâu nông nghiệp có liên quan.27, 28, 29Điều này mở ra triển vọng phát triển ngành công nghiệp thuốc trừ sâu, cải thiện hiệu quả và tính đặc hiệu của thuốc trừ sâu, đồng thời cho phép ứng dụng các hợp chất nhắm mục tiêu TRPV cho các loài khác nhằm giải quyết vấn đề an ninh lương thực toàn cầu và sự lây lan của các bệnh do côn trùng truyền.
Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng Nan-Iav được điều hòa bởi Ca2+, và cơ chế điều hòa được trung gian bởi CaM liên kết thường trực. Điều quan trọng là, sự điều hòa Nav phụ thuộc vào Ca2+ bởi CaM này khác biệt đáng kể so với cơ chế điều hòa của các kênh ion khác (ví dụ: kênh Na+ phụ thuộc điện thế và kênh TRPV5/6).52, 53, 54, 55, 56, 57Trong kênh Nav1.2, miền C-terminal của CaM liên kết xoắn ốc với miền C-terminal (CTD), và Ca2+ kích thích sự liên kết của miền N-terminal của nó với phần xa của CTD.56Trong kênh TRPV5/6, miền C-terminal của CaM liên kết với CTH, và Ca2+ gây ra sự mở rộng hướng lên của miền N-terminal của nó vào bên trong lỗ kênh, do đó ngăn chặn sự thẩm thấu cation.53,54Chúng tôi đề xuất một mô hình cho chức năng điều hòa bởi Ca2+ của Nan-Iav-CaM (Hình 4h). Trong mô hình này, miền N-terminal của CaM liên kết cố định với miền C-terminal (CTH) của Iav. Ở trạng thái nghỉ (nồng độ [Ca2+] thấp), miền C-terminal của CaM tương tác với Nan, ổn định cấu hình ARD và do đó thúc đẩy sự mở kênh. Sự liên kết của chất chủ vận/thuốc trừ sâu với kênh gây ra sự mở lỗ kênh, dẫn đến dòng Ca2+ đi vào. Sau đó, Ca2+ liên kết với CaM, gây ra sự phân ly của miền C-terminal khỏi ARD của Nan. Bởi vì việc ngăn chặn sự liên kết của CaM về cơ bản loại bỏ tác dụng ức chế của Ca2+, sự phân ly này điều chỉnh tính di động của ARD, do đó gây ra sự ức chế hoặc giảm nhạy cảm phụ thuộc vào Ca2+. Sự phục hồi nhanh chóng của dòng điện kênh sau khi ion canxi được giải phóng (Hình 4g) cho thấy cơ chế này tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng nhanh chóng đối với các tín hiệu thần kinh trung gian bởi Ca2+. Hơn nữa, vùng C-terminal của Iav, vốn vẫn chưa được hiểu rõ, được cho là đóng vai trò khác trong việc định hướng kênh và điều chỉnh dòng điện.21
Cuối cùng, nghiên cứu của chúng tôi trình bày cấu trúc độ phân giải cao của phức hợp kênh TRP thuốc trừ sâu có tầm quan trọng trong nông nghiệp – một khám phá mà trước đây chúng tôi chưa biết đến. Đặc biệt, chúng tôi đã mô tả đặc điểm cấu trúc và chức năng của kênh côn trùng trong tế bào người (HEK293S GnTi–) chứ không phải trong tế bào côn trùng. Trước tình trạng kháng thuốc trừ sâu ngày càng gia tăng và áp lực liên tục lên an ninh lương thực và mầm bệnh, công trình của chúng tôi cung cấp thông tin quan trọng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các loại thuốc trừ sâu mới vì lợi ích sức khỏe con người và an ninh lương thực toàn cầu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các loại thuốc trừ sâu như AP có hiệu quả chống lại một số loài gây hại khi được sử dụng theo hướng dẫn trên nhãn và có độc tính cấp tính thấp đối với các loài thụ phấn có lợi, chứng tỏ tính an toàn môi trường của chúng.13,16Hơn nữa, thử nghiệm một số dẫn xuất AP trên muỗi cho thấy chúng cuối cùng sẽ mất khả năng bay. Hiểu được cách các hợp chất điều hòa này liên kết với Nan-Iav sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc sửa đổi các hợp chất hiện có hoặc phát triển các hợp chất mới để đạt hiệu quả cao hơn.chính xácKiểm soát dịch hại. Nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng giao diện Nan-Iav ARD rất quan trọng không chỉ để điều chỉnh hoạt động của các hợp chất nội sinh, thuốc trừ sâu và Ca2+-CaM, mà còn cho quá trình lắp ráp kênh. Chúng tôi đề xuất rằng việc phá vỡ quá trình lắp ráp dị dimer bằng các phân tử nhỏ có thể là một phương pháp độc đáo và đầy hứa hẹn để phát triển các chất ức chế kênh ion.
Trong số tám gen tương đồng, các gen có độ dài đầy đủ của bọ cánh cứng nâu (Halyomorpha halys) Nanchung và Inactive đã được chọn, cho thấy độ ổn định tuyệt vời trong chất tẩy rửa. Các gen được tổng hợp đã được tối ưu hóa mã di truyền cho biểu hiện ở người và được nhân bản vào vector pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) bằng cách sử dụng các vị trí cắt giới hạn XhoI và EcoRI. Điều này đảm bảo rằng các bản sao nằm cùng khung với các thẻ GFP-FLAG-10xHis và mCherry-FLAG-10xHis ở đầu C, được cắt bởi protease HRC-3C (PPX), cho phép biểu hiện độc lập.sự biểu lộCác mồi được sử dụng để nhân bản Nanchung và Inactive vào vector pBacMam như sau:
Hình ảnh hiển vi của từng hạt riêng lẻ được thu thập bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Titan Krios G2 (FEI) được trang bị camera K3 và bộ lọc năng lượng Gatan BioQuantum. Kính hiển vi được vận hành ở mức 300 keV, với cài đặt năng lượng là 20 eV, kích thước điểm ảnh mẫu là 1,08 Å/pixel (độ phóng đại danh nghĩa là 81.000x) và độ lệch tiêu cự từ -0,8 đến -2,2 μm. Quá trình quay video được thực hiện ở tốc độ 40 khung hình/giây bằng kính hiển vi Latitude S (Gatan) với tốc độ liều danh nghĩa là 25 e–px−1 s−1, thời gian phơi sáng là 2,4 s và tổng liều khoảng 60 e–Å−2.
Việc hiệu chỉnh chuyển động do chùm tia gây ra và trọng số liều được thực hiện trên phim bằng MotionCor2 trong RELION 4.061. Việc ước tính tham số hàm truyền tương phản (CTF) được thực hiện trong cryoSPARC bằng phương pháp ước tính CTF dựa trên mảng ảnh62. Các ảnh hiển vi có độ phân giải phù hợp CTF ≥4 Å đã bị loại khỏi phân tích tiếp theo. Thông thường, một tập hợp con gồm 500–1000 ảnh hiển vi được sử dụng để chọn điểm trong cryoSPARC, sau đó là một số vòng phân loại 2D sau khi lọc để có được hình ảnh tham chiếu rõ ràng cho việc lựa chọn hạt dựa trên mẫu. Sau đó, các hạt được trích xuất bằng cách sử dụng hộp giới hạn 64 pixel và gộp 4 lần. Một số vòng phân loại 2D đã được thực hiện để loại bỏ các loại hạt không mong muốn. Mô hình 3D ban đầu được tái tạo bằng cách sử dụng tái tạo ab initio và được tinh chỉnh bằng cách tinh chỉnh không đồng nhất trong cryoSPARC. Phân loại 3D được thực hiện trong cryoSPARC hoặc RELION dựa trên tính không đồng nhất ARD. Không quan sát thấy tính không đồng nhất đáng kể của các miền màng. Các hạt được tinh chỉnh bằng phương pháp C1 và C2; các hạt có độ phân giải C2 cao hơn được coi là đối xứng so với C2 và được nhập vào RELION để tinh chỉnh Bayes. Sau đó, các hạt được chuyển trở lại cryoSPARC để tinh chỉnh cục bộ và không đồng nhất cuối cùng. Độ phân giải cuối cùng và số lượng hạt được hiển thị trong Bảng 1.
Khi xử lý các pentamer Nan+AP, chúng tôi đã thử nghiệm nhiều phương pháp khác nhau để cải thiện độ phân giải của các vùng màng (đặc biệt là vùng lỗ chân lông), chẳng hạn như phép trừ tín hiệu và che mặt nạ TMD. Tuy nhiên, những nỗ lực này đều không thành công do sự rối loạn tiềm tàng cực độ trong vùng lỗ chân lông và tính không đồng nhất tổng thể của TMD. Độ phân giải cuối cùng được tính toán bằng cách sử dụng mặt nạ được tạo tự động bởi phương pháp xử lý không đồng nhất trong cryoSPARC, chủ yếu nhắm vào vùng ARD. Điều này đạt được độ phân giải cao hơn đáng kể so với các vùng màng (đặc biệt là vùng VSLD).
Các mô hình ban đầu của dạng apo của vi khuẩn Nanchung và Inactive được tạo ra bằng Coot63, và các mô hình của vi khuẩn Nan và Iav được tạo ra bằng AlphaFold264 để xác định các vùng có độ tin cậy thấp. Mô hình Calmodulin dựa trên sự khớp vật thể cứng của các mô hình liên kết Ca2+ và không liên kết Ca2+ trong mã số PDB 4JPZ56 và 1CFD65 tương ứng. Các mô hình được tinh chỉnh bằng phương pháp tinh chỉnh hình cầu để đảm bảo cấu trúc lập thể chính xác và hình học tốt. Sau đó, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine và phosphatidylserine được mô hình hóa như các mật độ lipid được xác định rõ, và các phối tử NAM và AP được đặt trong các mật độ tương ứng trong các mối nối chặt chẽ. Các tệp ràng buộc được tạo ra từ chuỗi SMILES của các dạng đồng phân bằng eLBOW trong PHENIX66. Cuối cùng, các mô hình được tinh chỉnh trong không gian thực trong PHENIX bằng cách sử dụng tìm kiếm lưới cục bộ và tối thiểu hóa toàn cục với các ràng buộc cấu trúc thứ cấp. Máy chủ MolProbity được sử dụng để tinh chỉnh mô hình và phân tích cấu trúc, và các hình minh họa được thực hiện bằng PyMOL và UCSF Chimera X. 67,68,69 Phân tích khẩu độ được thực hiện bằng máy chủ HOLE,70 và lập bản đồ bảo tồn trình tự được thực hiện bằng máy chủ Consurf.71
Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm Igor Pro 6.2, Excel Office 365 và GraphPad Prism 7.0. Tất cả dữ liệu định lượng được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM). Kiểm định t của Student (hai phía, không ghép cặp) được sử dụng để so sánh hai nhóm. Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) tiếp theo là kiểm định hậu hoc Dunnett được sử dụng để so sánh nhiều nhóm. *P < 0.05< 0,05, **P< 0,01 và ***PGiá trị p < 0,001 được coi là có ý nghĩa thống kê tùy thuộc vào phân bố dữ liệu. Các giá trị Kd, Ki và khoảng tin cậy 95% bất đối xứng của chúng được tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism 10.
Để biết thêm chi tiết về phương pháp nghiên cứu, vui lòng xem Bản tóm tắt Báo cáo Danh mục Đầu tư Nature được liên kết trong bài viết này.
Mô hình ban đầu được xây dựng bằng cách sử dụng các mô hình calmodulin từ cơ sở dữ liệu PDB 4JPZ và 1CFD. Tọa độ đã được lưu trữ trong Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB) với các số hiệu truy cập 9NVN (Nan-Iav-CaM không có phối tử), 9NVO (Nan-Iav-CaM liên kết với nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM liên kết với nicotinamide và EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM liên kết với aphenidolpyrrolline và canxi), 9NVR (Nan-Iav-CaM liên kết với aphenidolpyrrolline và EDTA), và 9NVS (Nan pentamer liên kết với aphenidolpyrrolline). Các hình ảnh hiển vi điện tử đông lạnh tương ứng được lưu trữ trong Cơ sở dữ liệu hiển vi điện tử (EMDB) với các số hiệu truy cập sau: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM không có phối tử), EMD-49845 (phức hợp Nan-Iav-CaM với nicotinamide), EMD-49846 (phức hợp Nan-Iav-CaM với nicotinamide và EDTA), EMD-49847 (phức hợp Nan-Iav-CaM với aphidopyrrolline và canxi), EMD-49848 (phức hợp Nan-Iav-CaM với aphidopyrrolline và EDTA), và EMD-49849 (phức hợp Nan pentamer với aphidopyrrolline). Dữ liệu thô cho phân tích chức năng được trình bày trong bài báo này.
Thời gian đăng bài: 28/01/2026